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公開番号2025129399
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-09-04
出願番号2025114665,2023029982
出願日2025-07-07,2018-05-14
発明の名称二本鎖DNA合成方法
出願人国立大学法人神戸大学
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 15/10 20060101AFI20250828BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明は、PCR法を用いた二本鎖DNA断片の合成方法において、目的とする二本鎖DNA断片を、その配列によらず、正確に、容易に、効率よく、且つ迅速に合成できる方法を開発することを目的とする。
【解決手段】本発明は、短い二本鎖DNAを、オーバーラップエクステンションPCRにより連結して目的の二本鎖DNA断片を取得する、二本鎖DNA合成方法であって、上記オーバーラップエクステンションPCRのPCRサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする、二本鎖DNA合成方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
図面に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の二本鎖ＤＮＡ合成方法に関する。
続きを表示（約 3,800 文字）【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学の分野において新規の配列を有する長鎖のＤＮＡを構築するためのＤＮＡ合成は種々の目的のために行われている。この長鎖のＤＮＡを合成するための方法は、大きく分けて２つの工程からなる。第一の工程は、多数の一本鎖オリゴＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ断片を合成する工程である。第二の工程は、第一の工程にて得られた二本鎖ＤＮＡ断片を多数集積して長鎖のＤＮＡを構築する工程である。この長鎖のＤＮＡの構築方法としては、酵母集積法（非特許文献１参照）、Ｇｉｂｓｏｎａｓｓｅｎｂｌｙ法（非特許文献２参照）、Ｇｏｌｄｅｎｇａｔｅ法（非特許文献３参照）、ＬＣＲ法（非特許文献４参照）、ＯＧＡＢ法（非特許文献５参照）等が知られている。
【０００３】
上記二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法としては、例えばＰＣＲ反応溶液中で多数の相同領域を含む一本鎖オリゴＤＮＡ同士を同時に貼り合わせ、アセンブルすることで、二本鎖ＤＮＡ断片を合成する方法がいくつか知られている（特許文献１、非特許文献６～８参照）。これらの方法では、多数の一本鎖オリゴＤＮＡがひとつのＰＣＲ反応溶液に混在しているため、ＰＣＲ反応によってこれらの一本鎖オリゴＤＮＡを貼り合わせるとき、一本鎖オリゴＤＮＡ同士のミスマッチ、プライマーダイマーの形成等が起こるという不都合な事態を招く。上記理由のため、これらの合成方法では、合成しようとするいかなるＤＮＡ配列に対しても二本鎖ＤＮＡ断片を合成できるとは必ずしも限らない。特に、合成しようとする目的のＤＮＡ配列が、長い反復配列、連続した同一塩基配列等を含む複雑なＤＮＡ配列であると、合成が困難或いは不可能な場合もある。
【０００４】
また、これらの合成方法では、目的のＤＮＡ配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成するために、その出発材料となる一本鎖オリゴＤＮＡを設計しなければならない。これら一本鎖オリゴＤＮＡの設計の際には、ＰＣＲ反応のアニーリング温度の設定のため、多数の一本鎖オリゴＤＮＡを貼り合わせるための相同領域の長さを調節しなければならない。加えて、合成工程での一本鎖オリゴＤＮＡのヘアピン形成等を防ぐため、各一本鎖オリゴＤＮＡの長さ、数及びＧＣ含有量の構成等を調節する必要がある。即ち、これまでの合成方法においては、合成しようとする目的のＤＮＡ配列の一本鎖オリゴＤＮＡの設計が複雑であること、数個～数１００個単位の多数の二本鎖ＤＮＡ断片を合成しようとしても、それらのＤＮＡ配列ごとに一本鎖オリゴＤＮＡを設計しなければならないことから、一本鎖オリゴＤＮＡの設計に時間と手間がかかるという不都合が生じる。
【０００５】
上記第二の工程である長鎖のＤＮＡの合成においては、上記第一の工程で得られた多数の二本鎖ＤＮＡ断片を集積材料として用いる。上記第二の工程で長鎖のＤＮＡの合成において二本鎖ＤＮＡ断片を集積する際には、その二本鎖ＤＮＡ断片がひとつでも欠けてしまうと、目的とする長鎖のＤＮＡを合成することが不可能となる。しかし、これまでの二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法では、数個～数１００個単位の多数の二本鎖ＤＮＡ断片を合成するまでに時間と手間がかかるという不都合が生じること、合成しようとする目的のＤＮＡ配列の複雑性によっては、合成が困難或いは不可能であることから、集積材料となる全ての二本鎖ＤＮＡ断片を速やかに取得することが困難な状況である。即ち、これまでの二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法では、長鎖のＤＮＡの合成のための集積材料となる二本鎖ＤＮＡ断片を速やかに供給することができず、ボトルネックとなっているのが実情である。故に、これまでの合成方法に代わる、二本鎖ＤＮＡ断片の合成を効率よく迅速に合成できる新たな方法が強く求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
米国特許公開２００８０１８２２９６号
【非特許文献】
【０００７】
Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔａｌ. Ｓｃｉｅｎｃｅ，５８６７，１２１５－１２２０．，２００８
Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔａｌ. Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６，３４３－３４５．，２００９
Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．，ｅｔａｌ. ＰＬｏＳＯＮＥ，４，ｅ５５５３．，２００９
ＳｔｅｆａｎｄｅＫｏｋ，Ｓ．，ｅｔａｌ. ＡＣＳＳｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，３，９７－１０６．，２０１４
Ｔｓｕｇｅ，Ｋ．，ｅｔａｌ. ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３１，ｅ１３３．，２００３、Ｔｓｕｇｅ，Ｋ．，ｅｔａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，５，１０６５５．，２０１５
Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ，１６４，４９－５３．，１９９５
Ｘｉｏｎｇ，Ａ．，ｅｔａｌ．Ｎａｔ．ｐｒｏｔｏｃ．，１，７９１．，２００６
Ｘｉｏｎｇ，Ａ．Ｓ．，ｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３２，ｅ９８－ｅ９８．，２００４
Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ，Ｃ．，ａｎｄＰｅａｒｌ，Ｌ．Ｈ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，５，８２７－８２９．，１９９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような状況の中、本発明者らは、上述の不都合を解決し、長鎖ＤＮＡ合成のための集積材料として使用できる二本鎖ＤＮＡ断片を正確に、容易に、効率よく、且つ迅速に合成できる方法を開発することを目的として本研究を進めた。即ち、本発明は、ＰＣＲ法を用いた二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法において、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片を、その配列によらず、正確に、容易に、効率よく、且つ迅速に合成できる方法を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、短い二本鎖ＤＮＡを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得する二本鎖ＤＮＡ合成方法において、ＰＣＲサイクルのアニーリング温度設定を多段階とすることで、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片を正確に、容易に、効率よく、且つ迅速に合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
【００１０】
［１］短い二本鎖ＤＮＡを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得する、二本鎖ＤＮＡ合成方法であって、
上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［２］上記アニーリング温度設定が、２段階～２０段階である、［１］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［３］上記アニーリング温度設定が、６５℃～８５℃である、［１］又は［２］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［４］上記アニーリング温度設定の各段階における温度保持時間が、１０秒～２分である、［１］から［３］のいずれかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［５］上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおけるＤＮＡのオーバーラップ領域が１０塩基～４０塩基である、［１］から［４］のいずれかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［６］上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおいて、３種～２０種の短い二本鎖ＤＮＡが連結される、［１］から［５］のいずれかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［７］上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおいて用いられる短い二本鎖ＤＮＡが、プライマーエクステンションＰＣＲにより合成される、［１］から［６］のいずかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［８］上記プライマーエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有する、［７］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［９］上記プライマーエクステンションＰＣＲにより合成される短い二本鎖ＤＮＡのサイズが、１００塩基～３００塩基である、［７］又は［８］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［１０］二本鎖ＤＮＡ合成方法であって、
プライマーエクステンションＰＣＲにより短い二本鎖ＤＮＡを合成するプライマーエクステンションＰＣＲ工程、及び
オーバーラップエクステンションＰＣＲにより、上記プライマーエクステンションＰＣＲ工程において合成された二本鎖ＤＮＡを連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を合成するオーバーラップエクステンションＰＣＲ工程
を含み、上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ合成方法。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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