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公開番号
2025106504
公報種別
公開特許公報(A)
公開日
2025-07-15
出願番号
2025065143,2021551726
出願日
2025-04-10,2020-10-09
発明の名称
改変フェニルアラニン脱水素酵素
出願人
味の素株式会社
代理人
弁理士法人酒井国際特許事務所
主分類
C12N
9/06 20060101AFI20250708BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約
【課題】より高精度なフェニルアラニン測定に有用な手段および方法を提供する。
【解決手段】フェニルアラニンの測定に関連するフェニルアラニン脱水素酵素の特性(例、基質特異性、溶解性、およびフェニルアラニン脱水素酵素活性)を改善するようにその少なくとも1つのアミノ酸残基を変異させた、改変フェニルアラニン脱水素酵素;ならびに当該改変フェニルアラニン脱水素酵素を用いて被検試料中に含まれるフェニルアラニンを測定することを含む、フェニルアラニンの分析方法などを提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲
【請求項1】
モチーフ(1)~(6)(Xは任意のアミノ酸を示す)からなる群より選ばれる少なくとも1つのモチーフを含むフェニルアラニン脱水素酵素において、モチーフ(1)~(6)からなる群より選ばれる少なくとも1つのモチーフ中の少なくとも1つのアミノ酸残基が変異しており、
フェニルアラニン脱水素酵素活性を有し、かつ
基質特異性、溶解性、およびフェニルアラニン脱水素酵素活性からなる群より選ばれる少なくとも1つの特性が、野生型フェニルアラニン脱水素酵素よりも高い、
改変フェニルアラニン脱水素酵素:
モチーフ(1):GPALGGXRM(配列番号3)モチーフ;
モチーフ(2):GRFXTGTDMGT(配列番号4)モチーフ;
モチーフ(3):DFモチーフ;
モチーフ(4):GXANN(配列番号5)モチーフ;
モチーフ(5):RHモチーフ;
モチーフ(6):VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ。
続きを表示(約 3,400 文字)
【請求項2】
変異が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列における、下記からなる群より選ばれる1以上の置換である、請求項1記載の改変フェニルアラニン脱水素酵素:
(a)GPALGGXRM(配列番号3)モチーフ中のロイシンの置換;
(b)GRFXTGTDMGT(配列番号4)モチーフ中の7番目のアミノ酸残基であるスレオニンの置換;
(c)DFモチーフ中のフェニルアラニンの置換;
(d)GXANN(配列番号5)モチーフ中の4番目のアミノ酸残基であるアスパラギンの置換;
(e)RHモチーフ中のアルギニンの置換;
(f)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のアスパラギンの置換;
(g)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のロイシンの置換;
(h)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のグルタミンの置換;および
(i)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中の9番目のアミノ酸残基であるバリンの置換。
【請求項3】
変異が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列における、下記からなる群より選ばれる1以上の置換である、請求項2記載の改変フェニルアラニン脱水素酵素:
(a)GPALGGXRM(配列番号3)モチーフ中のロイシンのトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、またはメチオニンへの置換;
(b)GRFXTGTDMGT(配列番号4)モチーフ中の7番目のアミノ酸残基であるスレオニンのセリンへの置換;
(c)DFモチーフ中のフェニルアラニンのロイシンまたはイソロイシンへの置換;
(d)GXANN(配列番号5)モチーフ中の4番目のアミノ酸残基であるアスパラギンのグリシン、グルタミン、スレオニン、リジン、プロリン、またはセリンへの置換;
(e)RHモチーフ中のアルギニンのアスパラギン酸またはグルタミン酸への置換;
(f)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のアスパラギンのバリン、アスパラギン酸、メチオニン、グルタミン、プロリン、イソロイシン、ヒスチジン、アラニン、スレオニン、グリシン、またはシステインへの置換;
(g)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のロイシンのフェニルアラニン、グルタミン、ヒスチジン、アスパラギン、イソロイシン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、スレオニン、またはセリンへの置換;
(h)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のグルタミンのアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、セリン、またはアルギニンへの置換;および
(i)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中の9番目のアミノ酸残基であるバリンのチロシン、トリプトファン、グルタミン酸、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、リジン、グリシン、セリン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、システイン、またはアルギニンへの置換。
【請求項4】
フェニルアラニン脱水素酵素は、モチーフ(1)~(6)の全てをこの順序で含む、請求項1~3のいずれか一項記載の改変フェニルアラニン脱水素酵素。
【請求項5】
フェニルアラニン脱水素酵素が、Thermoactinomyces属に由来する、請求項1~4のいずれか一項記載の改変フェニルアラニン脱水素酵素。
【請求項6】
フェニルアラニン脱水素酵素が、
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列、
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
(C)配列番号1で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項1~5のいずれか一項記載の改変フェニルアラニン脱水素酵素。
【請求項7】
下記:
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列、
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
(C)配列番号1で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を含むフェニルアラニン脱水素酵素において、
下記:
R2、R10、Y11、C19、L41、G42、G43、C44、A50、S51、M66、C70、F77、K90、Y112、T115、D116、F124、R129、L137、K139、S140、K144、T147、K173、C200、C210、K216、K220、Q222、N227、R228、C234、C240、R255、C256、L257、N264、R271、Q277、K278、R279、S280、C282、N290、G293、L294、Q296、V297、R326、K328、N329、N331、C335、R340、K347、およびK348
より選ばれる1以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含み、
フェニルアラニン脱水素酵素活性を有し、かつ、
基質特異性、溶解性、およびフェニルアラニン脱水素酵素活性からなる群より選ばれる1以上の特性が改善されている、
改変フェニルアラニン脱水素酵素。
【請求項8】
下記より選ばれる1以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の置換を含む、請求項7記載の改変フェニルアラニン脱水素酵素:
R2D、R2E、R10D、R10E、Y11E、Y11D、C19A、C19S、L41W、L41F、L41Y、L41M、G42A、G43A、C44A、C44S、A50D、A50E、S51D、S51E、M66I、M66L、M66V、C70A、C70S、F77L、F77I、F77R、K90E、Y112L、T115S、D116E、F124L、F124I、R129K、L137V、K139E、S140A、K144G、T147A、T147S、T147N、K173E、K173D、C200A、C200S、C210S、C210A、K216D、K216E、K220D、K220E、Q222E、Q222D、N227D、N227E、R228E、R228D、C234A、C234S、C240S、C240A、R255E、R255D、C256A、C256S、L257K、N264G、N264Q、N264T、N264K、N264P、N264S、R271D、R271E、Q277D、K278D、K278E、R279D、R279E、S280D、C282S、C282A、N290V、N290D、N290M、N290Q、N290P、N290I、N290H、N290A、N290T、N290G、N290C、G293A、L294F、L294Q、L294H、L294N、L294I、L294D、L294G、L294E、L294T、L294S、Q296D、Q296E、Q296K、Q296N、Q296S、Q296R、V297Y、V297W、V297E、V297N、V297T、V297I、V297K、V297G、V297S、V297L、V297M、V297Q、V297F、V297C、V297R、R326E、K328E、K328D、N329D、N331E、N331D、C335A、C335S、R340D、R340E、K347D、およびK348E。
【請求項9】
請求項1~8のいずれか一項記載の改変フェニルアラニン脱水素酵素を用いて被検試料中に含まれるフェニルアラニンを測定することを含む、フェニルアラニンの分析方法。
【請求項10】
被検試料をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)と混合し、改変フェニルアラニン脱水素酵素の作用によりNAD+から生成したNADHを検出することを含む、請求項9記載の方法。
(【請求項11】以降は省略されています)
発明の詳細な説明
【技術分野】
【0001】
本発明は、改変フェニルアラニン脱水素酵素、およびそれを用いるフェニルアラニンの分析方法などに関する。
続きを表示(約 4,500 文字)
【背景技術】
【0002】
アミノ酸の一種であるフェニルアラニンは、フェニルケトン尿症(遺伝性フェニルアラニン代謝異常疾患)の患者の血中、尿中に多量に貯留されるバイオマーカーであり、フェニルアラニンの測定は臨床診断上きわめて重要である。また、フェニルケトン尿症患者は、低フェニルアラニン含量の食餌制限が必要であり、食品中のフェニルアラニン含量の測定も重要である。フェニルアラニンの測定方法としては、Thermoactinomyces intermedius由来フェニルアラニン脱水素酵素を用いた酵素的測定方法(例えば、特許文献1)が知られている。
【0003】
フェニルアラニンの測定方法としては、Thermoactinomyces intermedius由来フェニルアラニン脱水素酵素を用いた酵素的測定方法(例えば、特許文献1)が知られている。また、フェニルアラニン脱水素酵素の活性等に関与するアミノ酸残基の解析が行われている(非特許文献1~4)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
特公平7-114713号公報
【非特許文献】
【0005】
J Biochem. 1994 Dec;116(6):1370-1376
Biochemistry 2000, 39, 31, 9174-9187
Journal of Biotechnology Volume 142, Issue 2, 15 June 2009, Pages 127-134
PNAS 2016 113 (47) E7383-E7389
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
前述の酵素を用いたフェニルアラニン測定では、フェニルアラニンの測定に関連する酵素の特性(例、基質特異性、溶解性、および酵素活性)が優れることが望ましい。しかし、野生型フェニルアラニン脱水素酵素は、例えば、チロシンに対する反応性を示すことから基質特異性が低く、フェニルアラニンの測定精度が低くなる問題がある。また、野生型フェニルアラニン脱水素酵素は、水溶性が低いことから懸濁液の状態で提供され、凝集等により酵素使用量の偏析が生じ、フェニルアラニンの測定精度への影響が懸念される。そこで、より高精度なフェニルアラニン測定への実用化に際し、より高い基質特異性、溶解性、および酵素活性を有する酵素が求められている。
【0007】
本発明は、より高精度なフェニルアラニン測定への実用化に適した改変フェニルアラニン脱水素酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、鋭意検討した結果、フェニルアラニンの測定に関連する特性(例、基質特異性、溶解性、および酵素活性)を改善した酵素を用いることにより、フェニルアラニン濃度を測定すればよいことを着想し、そして、このような特性が改善されたフェニルアラニン脱水素酵素を開発することに成功し、もって本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔1〕モチーフ(1)~(6)(Xは任意のアミノ酸を示す)からなる群より選ばれる少なくとも1つのモチーフを含むフェニルアラニン脱水素酵素において、モチーフ(1)~(6)からなる群より選ばれる少なくとも1つのモチーフ中の少なくとも1つのアミノ酸残基が変異しており、
フェニルアラニン脱水素酵素活性を有し、かつ
基質特異性、溶解性、およびフェニルアラニン脱水素酵素活性からなる群より選ばれる少なくとも1つの特性が、野生型フェニルアラニン脱水素酵素よりも高い、
改変フェニルアラニン脱水素酵素:
モチーフ(1):GPALGGXRM(配列番号3)モチーフ;
モチーフ(2):GRFXTGTDMGT(配列番号4)モチーフ;
モチーフ(3):DFモチーフ;
モチーフ(4):GXANN(配列番号5)モチーフ;
モチーフ(5):RHモチーフ;
モチーフ(6):VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ。
〔2〕変異が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列における、下記からなる群より選ばれる1以上の置換である、〔1〕の改変フェニルアラニン脱水素酵素:
(a)GPALGGXRM(配列番号3)モチーフ中のロイシンの置換;
(b)GRFXTGTDMGT(配列番号4)モチーフ中の7番目のアミノ酸残基であるスレオニンの置換;
(c)DFモチーフ中のフェニルアラニンの置換;
(d)GXANN(配列番号5)モチーフ中の4番目のアミノ酸残基であるアスパラギンの置換;
(e)RHモチーフ中のアルギニンの置換;
(f)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のアスパラギンの置換;
(g)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のロイシンの置換;
(h)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のグルタミンの置換;および
(i)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中の9番目のアミノ酸残基であるバリンの置換。
〔3〕変異が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列における、下記からなる群より選ばれる1以上の置換である、〔2〕の改変フェニルアラニン脱水素酵素:
(a)GPALGGXRM(配列番号3)モチーフ中のロイシンのトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、またはメチオニンへの置換;
(b)GRFXTGTDMGT(配列番号4)モチーフ中の7番目のアミノ酸残基であるスレオニンのセリンへの置換;
(c)DFモチーフ中のフェニルアラニンのロイシンまたはイソロイシンへの置換;
(d)GXANN(配列番号5)モチーフ中の4番目のアミノ酸残基であるアスパラギンのグリシン、グルタミン、スレオニン、リジン、プロリン、またはセリンへの置換;
(e)RHモチーフ中のアルギニンのアスパラギン酸またはグルタミン酸への置換;
(f)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のアスパラギンのバリン、アスパラギン酸、メチオニン、グルタミン、プロリン、イソロイシン、ヒスチジン、アラニン、スレオニン、グリシン、またはシステインへの置換;
(g)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のロイシンのフェニルアラニン、グルタミン、ヒスチジン、アスパラギン、イソロイシン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、スレオニン、またはセリンへの置換;
(h)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中のグルタミンのアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、セリン、またはアルギニンへの置換;および
(i)VNXGGLIQV(配列番号6)モチーフ中の9番目のアミノ酸残基であるバリンのチロシン、トリプトファン、グルタミン酸、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、リジン、グリシン、セリン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、システイン、またはアルギニンへの置換。
〔4〕フェニルアラニン脱水素酵素は、モチーフ(1)~(6)の全てをこの順序で含む、〔1〕~〔3〕のいずれかの改変フェニルアラニン脱水素酵素。
〔5〕フェニルアラニン脱水素酵素が、Thermoactinomyces属に由来する、〔1〕~〔4〕のいずれかの改変フェニルアラニン脱水素酵素。
〔6〕フェニルアラニン脱水素酵素が、
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列、
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
(C)配列番号1で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、〔1〕~〔5〕のいずれかの改変フェニルアラニン脱水素酵素。
〔7〕下記:
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列、
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
(C)配列番号1で表されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を含むフェニルアラニン脱水素酵素において、
下記:
R2、R10、Y11、C19、L41、G42、G43、C44、A50、S51、M66、C70、F77、K90、Y112、T115、D116、F124、R129、L137、K139、S140、K144、T147、K173、C200、C210、K216、K220、Q222、N227、R228、C234、C240、R255、C256、L257、N264、R271、Q277、K278、R279、S280、C282、N290、G293、L294、Q296、V297、R326、K328、N329、N331、C335、R340、K347、およびK348
より選ばれる1以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の変異を含み、
フェニルアラニン脱水素酵素活性を有し、かつ、
基質特異性、溶解性、およびフェニルアラニン脱水素酵素活性からなる群より選ばれる1以上の特性が改善されている、
改変フェニルアラニン脱水素酵素。
〔8〕下記より選ばれる1以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の置換を含む、〔7〕の改変フェニルアラニン脱水素酵素:
【発明の効果】
【0010】
本発明の改変フェニルアラニン脱水素酵素は、その基質特異性が改善されていることから、フェニルアラニンの迅速、高精度、かつ高感度な測定および/またはフェニルピルビン酸(phenylpyruvate)の製造に有用である。本発明の改変フェニルアラニン脱水素酵素はまた、溶解性が向上しているため、凝集等による酵素使用量の偏析が生じず、均一かつ高精度なフェニルアラニンの測定に有用である。本発明の改変フェニルアラニン脱水素酵素はさらに、フェニルアラニン脱水素酵素活性が向上しているため、フェニルアラニンの迅速かつ高感度な測定および/またはフェニルピルビン酸(phenylpyruvate)の製造に有用である。本発明の改変フェニルアラニン脱水素酵素は、特に液状試薬として有用である。本発明の分析方法は、例えば、フェニルケトン尿症等の疾患の診断、および食品中のフェニルアラニン含量の測定に有用である。
【図面の簡単な説明】
(【0011】以降は省略されています)
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