特許ウォッチ

公開番号2025040334
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-24
出願番号2023147198
出願日2023-09-11
発明の名称異種移植用材料の病原体感染を検査するための剤、検査キット、異種移植用材料の病原体感染を検査する方法、及び病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法
出願人学校法人常翔学園
代理人個人,個人
主分類C12Q 1/6888 20180101AFI20250314BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】複数種類の病原体検査を行うに際し、個々の病原体毎に異なるプライマーを用いて同様の検査作業を行う重複的な作業を低減し、複数種類の病原体検査をできるだけ少ない回数で簡便に行うことができる異種移植用材料の病原体感染を検査するための剤、検査キット、異種移植用材料の病原体感染を検査する方法、及び病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法を提供すること。
【解決手段】特定の病原体に対するプライマー対の群から選択される少なくとも1つの、病原体の核酸に選択的に結合するプライマー対を含む、異種移植用材料の病原体感染をPCR検査するための剤。
【選択図】図2
特許請求の範囲【請求項１】
アポイウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－GGG ACA CCC GAG TAA CTC AA－３’（配列番号１）
Ｒ：５’－TGC CTC TGC TAG CCT TTT ATG－３’（配列番号２）
ボルナウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－GGC CGA RAA TAG CAT GAT MGA－３’（配列番号３）
Ｒ：５’－GCT GAG CTG TCT GGA TGG TTT－３’（配列番号４）
牛ウイルス性下痢ウイルス１型に対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－AGC AAC AGT GGT GAG TTC GTT－３’（配列番号５）
Ｒ：５’－CGA ACC ACT GAC GAC TAC CC－３’（配列番号６）
牛ウイルス性下痢ウイルス２型に対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－ACA AAC CCC CTG AAT CAA GA－３’（配列番号７）
Ｒ：５’－AGC AGA ACY GCT GCC AAG AT－３’（配列番号８）
牛ウイルス性下痢ウイルス３型に対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－AAC AAA CCA GAA CAG TCA AGG AA－３’（配列番号９）
Ｒ：５’－CAG TAY TGC CCA TGC CAA C－３’（配列番号１０）
ブタコレラウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－CAG GAC AGT CGT CAG TAG TTC G－３’（配列番号１１）
Ｒ：５’－CTC GTC CAC ATA GCA TCT CG－３’（配列番号１２）
ゲタウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－AAA ACT GAC AAA CCC GGA AA－３’（配列番号１７）
Ｒ：５’－CTG TAT GGT GGC TAC GTT CG－３’（配列番号１８）
日本脳炎ウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－TGT CAT GGA TGA AGC TCA TTT C－３’（配列番号２１）
Ｒ：５’－TTG GTA GCA ATG TAT CCT CGT G－３’（配列番号２２）
レオウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－TCA ARA TGG TWA GCG TTG GA－３’（配列番号２３）
Ｒ：５’－GCC ATG AAT AGT GTC TGW GCA A－３’（配列番号２４）
ニパウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－TCA GCA GGA AGG CAA GAG AGT AA－３’（配列番号２７）
Ｒ：５’－CCY CTT CRT CGA YAT CTT GAT CA－３’（配列番号２８）
アストロウイルス４型に対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－ACA GCG CTG CAT GGG AAA CTC CT－３’（配列番号３４）
Ｒ：５’－CTT TGG TCC KCC CCY CCA AA－３’（配列番号３５）
ブタ流行性下痢ウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－GCC GAC AGG TCT GCA TTC－３’（配列番号４４）
Ｒ：５’－TAA GGA GTG TTA GCG TTA CAC CAG－３’（配列番号４５）
ブタエンテロウイルスＢ型に対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－ATG CAC GCA ACA CAC AAG AT－３’（配列番号４６）
Ｒ：５’－TTC TGC CAT TAT GCC ATG C－３’（配列番号４７）
ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－CCG ACA TTG ACG GAG TCT TC－３’（配列番号４８）
Ｒ：５’－CAA TGT CAG CCG GGG TAT TA－３’（配列番号４９）
ブタ呼吸器型コロナウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－TGT GCT AGT TAT GTG GCT AAT GTT T－３’（配列番号５２）
Ｒ：５’－CCA CTA ACC AAC GTG GAG CTA T－３’（配列番号５３）
ロタウイルスグループＡに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－HGA AAG RTT CAG TTT TCC GAG RG－３’（配列番号５４）
Ｒ：５’－RAA TAA CTG GAT TGA AGT ACC ATG TG－３’（配列番号５５）
ロタウイルスグループＢ（米国株）に対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－CAY GAA CAT TTC TGY GGT GG－３’（配列番号５６）
続きを表示（約 2,700 文字）【請求項２】
アポイウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－GGG ACA CCC GAG TAA CTC AA－３’（配列番号１）
Ｒ：５’－TGC CTC TGC TAG CCT TTT ATG－３’（配列番号２）
ボルナウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－GGC CGA RAA TAG CAT GAT MGA－３’（配列番号３）
Ｒ：５’－GCT GAG CTG TCT GGA TGG TTT－３’（配列番号４）
牛ウイルス性下痢ウイルス１型に対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－AGC AAC AGT GGT GAG TTC GTT－３’（配列番号５）
Ｒ：５’－CGA ACC ACT GAC GAC TAC CC－３’（配列番号６）
牛ウイルス性下痢ウイルス２型に対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－ACA AAC CCC CTG AAT CAA GA－３’（配列番号７）
Ｒ：５’－AGC AGA ACY GCT GCC AAG AT－３’（配列番号８）
牛ウイルス性下痢ウイルス３型に対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－AAC AAA CCA GAA CAG TCA AGG AA－３’（配列番号９）
Ｒ：５’－CAG TAY TGC CCA TGC CAA C－３’（配列番号１０）
ブタコレラウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－CAG GAC AGT CGT CAG TAG TTC G－３’（配列番号１１）
Ｒ：５’－CTC GTC CAC ATA GCA TCT CG－３’（配列番号１２）
脳心筋炎ウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－TCG ATG CCA ACG AGG AC－３’（配列番号１３）
Ｒ：５’－CTC TGG GTT GTT TAG TGT TTC T－３’（配列番号１４）
口蹄疫ウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－ACT GGG TTT TAY AAA CCT GTG ATG－３’（配列番号１５）
Ｒ：５’－TCA ACT TCT CCT GKA TGG TCC CA－３’（配列番号１６）
ゲタウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－AAA ACT GAC AAA CCC GGA AA－３’（配列番号１７）
Ｒ：５’－CTG TAT GGT GGC TAC GTT CG－３’（配列番号１８）
ブタE型肝炎ウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－GGT GGT TTC TGG GGT GAC－３’（配列番号１９）
Ｒ：５’－AGG GGT TGG TTG GAT GAA－３’（配列番号２０）
日本脳炎ウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－TGT CAT GGA TGA AGC TCA TTT C－３’（配列番号２１）
Ｒ：５’－TTG GTA GCA ATG TAT CCT CGT G－３’（配列番号２２）
レオウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－TCA ARA TGG TWA GCG TTG GA－３’（配列番号２３）
Ｒ：５’－GCC ATG AAT AGT GTC TGW GCA A－３’（配列番号２４）
メナングルウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－CGG ATT TGA GCC TGG TAC GT－３’（配列番号２５）
Ｒ：５’－ACC TCT CCA TTT GTC ATC GGA－３’（配列番号２６）
ニパウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－TCA GCA GGA AGG CAA GAG AGT AA－３’（配列番号２７）
Ｒ：５’－CCY CTT CRT CGA YAT CTT GAT CA－３’（配列番号２８）
ノロウイルスに対する下記プライマー対、
Ｆ(Aプライマー)：５’－ATG TTY AGR TGG ATG AGR TTY T－３’（配列番号２９）
Ｆ(Bプライマー)：５’－ATG TTC CGY TGG ATG CGV TT－３’（配列番号３０）
Ｒ：５’－TMG AYG CCA TCW TCA TTC AC－３’（配列番号３１）
アストロウイルス１型、３型及び／又は５型に対する下記プライマー対、
Ｆ：５’－GAA KCR CTS YAT GGG AAR CTC CT－３’（配列番号３２）
Ｒ：５’－CTT TGG TCC KCC CCY CCA AA－３’（配列番号３３）
アストロウイルス４型に対する下記プライマー対、
【請求項３】
前記プライマー対を、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は６つ以上含む、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
前記プライマー対を、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上又は２９以上含む、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項５】
各々の細菌の核酸に選択的に結合するプライマー対、及び／又は、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマー対を更に含む、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項６】
前記異種移植用材料が、ブタ由来の異種移植用材料である、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項７】
含まれる全プライマーの融解温度差が７℃以下であり、ウイルス、原虫及び細菌を含む病原体の感染を同一のサーマルサイクル条件のＰＣＲ法により遺伝子検査するための、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の剤を含む検査キット。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の剤を使用して、ウイルス、原虫及び細菌を含む病原体の感染を遺伝子検査する工程を含む、異種移植用材料の病原体感染を検査する方法。
【請求項１０】
各々の細菌の核酸に選択的に結合するプライマー対、及び／又は、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマー対を更に使用する、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種の病原体検査をできるだけ少ない回数で簡便に行うことができる異種移植用材料の病原体感染を検査するための剤、検査キット、異種移植用材料の病原体感染を検査する方法、及び病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法に関する。
続きを表示（約 2,500 文字）【背景技術】
【０００２】
世界的に見ても、移植待機患者数はかなり多いにもかかわらず、提供される臓器は不足している。最近では、ブタの胎児を用いた再生療法、ブタで育てた遺伝子操作ヒト臓器が注目されている。このような臨床応用に使用されるブタは、ブタ、ウシ、霊長類等の家畜だけでなく、ヒトへの感染を防ぐために、微生物学的に安全であること、すなわち感染性病原体が存在しないことが要求される。
【０００３】
異種移植のドナーとなるのはＤＰＦ（ＤｅｓｉｇｎａｔｅｄＰａｔｈｏｇｅｎＦｒｅｅ）ブタと呼ばれる、閉鎖系のよく管理された環境において、医療用として飼育された感染症、特に人獣共通感染症のリスクを排除したブタが多い。
【０００４】
ドナーブタの病原体を検出するための微生物学的手法には、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）分析、微生物培養、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着分析法）などがある。異種移植を目的としたブタの微生物学的安全性の検査は、従来、これらの技術を組み合わせることによって達成されている（非特許文献１及び２）。
病原体検査ないしスクリーニングのための微生物学的手法のうち、ＰＣＲ分析は、その感度と結果を得るのに必要な時間が比較的短いことから、通常、第一の選択肢となり得る。
【０００５】
例えば、非特許文献３には、ＰＣＲ技術に基づいた、ドナーブタの感染性病原体を検出するための異種移植パネルが記載されており、２３種のウイルス、及び、２種の細菌を検出するＰＣＲ検出法が記載されている。
非特許文献３に記載の病原体リストは、非特許文献３に記載の地域の地理的範囲内でドナーブタに感染する可能性の高い微生物に従って確立されており、ドナーブタが飼育されている地域の感染状況によって限定されたものとなる（例えば、非特許文献１～５）。
【０００６】
したがって、ルーチンに検査する病原体の数を絞り込むことを目指すには病原体検査にかかるコスト及び時間がやむを得ない要因として浮上してくる。しかし、稀な感染及び／又は季節的な感染を引き起こす病原体など、他の病原体を検出できる高感度ＰＣＲ検出法を開発することも極めて重要である。
さらに、より多くの検出法があれば、異種移植用に指定されたドナーブタ（例えば、上記ＤＰＦブタ）が開発された、あるいは開発されつつある国、地域等における病原体検査のための標的病原体リストの作成に、より多くの選択肢を提供することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
ＷｙｎｙａｒｄＳ，ＮａｔｈｕＤ，ＧａｒｋａｖｅｎｋｏＯ，ｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｆｅｔｙｏｆｔｈｅｆｉｒｓｔｃｌｉｎｉｃａｌｐｉｇｉｓｌｅｔｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｔｒｉａｌｉｎＮｅｗＺｅａｌａｎｄ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ２０１４；２１：３０９‐３２３．
ＧａｚｄａＬＳ，ＣｏｌｌｉｎｓＪ，ＬｏｖａｔｔＡｅｔａｌ．Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｆｅｔｙａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒａｇａｒｏｓｅｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｐｏｒｃｉｎｅｉｓｌｅｔｓｉｎｔｅｎｄｅｄｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ２０１６；２３：４４４‐４６３．
ＨａｒｔｌｉｎｅＣＢ，ＣｏｎｎｅｒＲＬ，ＪａｍｅｓＳＨｅｔａｌ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｐａｎｅｌｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｇｅｎｔｓｉｎｐｉｇｓ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ２０１８；２５：ｅ１２４２７．
ＦｉｓｈｍａｎＪＡ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｒｉｓｋｓｉｎｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１８；１８：１８５７‐１８６４．
ＰｏｒｒｅｔｔＰＭ，ＯｒａｎｄｉＢＪ，ＫｕｍａｒＶｅｔａｌ．Ｆｉｒｓｔｃｌｉｎｉｃａｌ‐ｇｒａｄｅｐｏｒｃｉｎｅｋｉｄｎｅｙｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔｕｓｉｎｇａｈｕｍａｎｄｅｃｅｄｅｎｔｍｏｄｅｌ．ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ２０２２；２２：１０３７‐１０５３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のような異種移植用動物（例えば、ブタ、ウシ、霊長類等）に関する複数種類の病原体（例えば、複数種類の細菌、ウイルス、原虫）感染を検査するに際し、個々の病原体毎にＰＣＲ等により検査するのでは、手間、時間及び費用を要し検査の実用性としては現実的ではない。例えば、６０時間以上の長時間の検査時間を要する。複数種類の病原体感染を、できるだけ少ない回数で検査し得る手法が求められる。
【０００９】
例えば、ＰＣＲ法により複数種類の病原体感染を、できるだけ少ない回数で検査する場合、同一のＰＣＲ反応に使う各プライマーの融解温度（Ｔｍ値）が、ＰＣＲにおけるアニーリング工程との相関性の観点から所定の差に収まるように設計すること等が要求される。
しかし、上述のように、検査対象の病原体の種類が増えるほど、同一のＰＣＲ反応に使う各プライマーの融解温度（Ｔｍ値）が所定の差に収まるように設計することは困難になってくる。
【００１０】
一方、本発明者らは定量的ＰＣＲでは、ほとんどの病原体において標準ＰＣＲ法及びｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法と比較して検出感度が高いこと、その為、全ての病原体の検出方法を定量的ＰＣＲに統一することが好ましいことを見出している。
（【００１１】以降は省略されています）

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