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公開番号2024126464
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-20
出願番号2023034848
出願日2023-03-07
発明の名称-SH基含有化合物検出型ラマンプローブ
出願人国立大学法人東京工業大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類G01N 21/65 20060101AFI20240912BHJP(測定;試験)
要約【解決課題】
新規な-SH基含有化合物(例えば、グルタチオン)検出型ラマンプローブを提供すること。
【解決手段】
-SH基を含有する化合物を検出する方法であって、
(a)以下の一般式(I)で表される化合物又はその塩を、-SH基を含有する化合物と接触させる工程、及び
(b)一般式(I)で表される化合物又はその塩が-SH基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、当該方法。
特許請求の範囲【請求項１】
－ＳＨ基を含有する化合物を検出する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、－ＳＨ基を含有する化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、
当該方法。
TIFF
2024126464000021.tif
55
157
（式中、
Ｒ
１
は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ
２
及びＲ
３
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
４
及びＲ
５
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
６
及びＲ
７
は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ
８
及びＲ
９
は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒ
ａ
）（Ｒ
ｂ
）、Ｃ（Ｒ
ａ
）（Ｒ
ｂ
）又はＰ（＝Ｏ）Ｒ
ｃ
から選択され、
ここで、Ｒ
ａ
及びＲ
ｂ
は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒ
ｃ
は、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
続きを表示（約 2,900 文字）【請求項２】
Ｒ
１
の一価の置換基は、芳香族環における２位又は６位の位置に置換基を有しないか、あるいは、２位及び６位の位置に置換基を有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ
１
の一価の置換基は、ベンゼン環における２位及び６位の位置に置換基を有しない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
一般式（Ｉ）のキサンテン骨格の３位、６位の窒素原子の少なくとも一方の窒素原子上で環構造が形成されている、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
（ａ）の工程において、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩、及び－ＳＨ基を含有する化合物を接触させる、請求項１に記載の方法。
TIFF
2024126464000022.tif
45
161
（式中、
Ｒ
１
は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ
２
及びＲ
３
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
４
及びＲ
５
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
６
及びＲ
７
は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ
８
及びＲ
９
は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ
ａ
は、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒ
ｄ
）（Ｒ
ｅ
）、Ｃ（Ｒ
ｄ
）（Ｒ
ｅ
）又はＰ（＝Ｏ）Ｒ
ｆ
から選択され、
ここで、Ｒ
ｄ
及びＲ
ｅ
は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒ
ｆ
は、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
【請求項６】
－ＳＨ基を含有する化合物の濃度を定量的に検出することができる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
－ＳＨ基を含有する化合物がシステイン残基を有する化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
－ＳＨ基を含有する化合物がグルタチオンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、－ＳＨ基を含有する化合物検出用ラマンプローブ。
TIFF
2024126464000023.tif
55
155
（式中、
Ｒ
１
は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ
２
及びＲ
３
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
４
及びＲ
５
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
６
及びＲ
７
は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ
８
及びＲ
９
は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒ
ａ
）（Ｒ
ｂ
）、Ｃ（Ｒ
ａ
）（Ｒ
ｂ
）又はＰ（＝Ｏ）Ｒ
ｃ
から選択され、
ここで、Ｒ
ａ
及びＲ
ｂ
は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒ
ｃ
は、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。
【請求項１０】
以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を更に含む、請求項９に記載のラマンプローブ。
TIFF
2024126464000024.tif
45
153
（式中、
Ｒ
１
は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ
２
及びＲ
３
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
４
及びＲ
５
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
６
及びＲ
７
は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ
８
及びＲ
９
は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ
ａ
は、芳香族環上の２位及び６位の少なくとも１つの位置に結合している一価の置換基であり；
Ｙは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒ
ｄ
）（Ｒ
ｅ
）、Ｃ（Ｒ
ｄ
）（Ｒ
ｅ
）又はＰ（＝Ｏ）Ｒ
ｆ
から選択され、
ここで、Ｒ
ｄ
及びＲ
ｅ
は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒ
ｆ
は、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な－ＳＨ基含有化合物検出型ラマンプローブに関わる。
続きを表示（約 3,700 文字）【背景技術】
【０００２】
生体内の酸化還元レベルを調節する分子としてグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）が知られている。ＧＳＨは細胞内に０．５－１０ｍＭで存在しており、生きた細胞でその濃度を迅速に定量する手法が望まれてきた。
【０００３】
本発明者らは、これまでに、特定のローダミン誘導体がＧＳＨと可逆的に反応して吸収・蛍光特性を変化させる特性を見出し、生きた細胞で迅速にＧＳＨ濃度を定量可能なＱＧプローブの開発に成功してきた（非特許文献１）。しかしながら、ＧＳＨ濃度を定量するために２つの蛍光色素の蛍光ｒａｔｉｏ値を測定する必要があり、細胞イメージングに汎用される可視光領域を大きく占有してしまうことが課題の１つであった。
【０００４】
一方で、分子振動を検出するラマンイメージングは、蛍光イメージングと比べて多色イメージングに秀でたイメージング手法として注目を浴びている。本発明者らが所属する研究室ではこれまでに、ｓｉｌｅｎｔｒｅｇｉｏｎ（１８００―２８００ｃｍ
－１
）で強いラマン信号を示す９ＣＮ－ｐｙｒｏｎｉｎ（非特許文献２，３）の誘導体がＧＳＨとの反応性を示すことを見出したため、これらがＧＳＨプローブとして利用可能かどうかを評価してきた。その結果，先述したローダミン類のようなＧＳＨとの可逆的な反応が起こるものの、一部不可逆的な分解も起こることが明らかとなり、９ＣＮ－ｐｙｒｏｎｉｎ誘導体を用いて可逆的にＧＳＨ濃度を定量するのは困難であることが示唆されていた（図１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Umezawa, K.; Yoshida, M.; Kamiya, M.; Yamasoba, T.; Urano, Y. Rational Design of Reversible Fluorescent Probes for Live-Cell Imaging and Quantification of Fast Glutathione Dynamics. Nat. Chem. 2017, 9 (3), 279-286.
Miao, Y.; Qian, N.; Shi, L.; Hu, F.; Min, W. 9-Cyanopyronin Probe Palette for Super-Multiplexed Vibrational Imaging. Nat. Commun. 2021, 12 (1), 4518.
Fujioka, H.; Shou, J.; Kojima, R.; Urano, Y.; Ozeki, Y.; Kamiya, M. Multicolor Activatable Raman Probes for Simultaneous Detection of Plural Enzyme Activities. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142 (49), 20701-20707.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な－ＳＨ基含有化合物（例えば、グルタチオン）検出型ラマンプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そのような中、本発明者らは前期共鳴（electronic pre-resonance、ＥＰＲ）ラマン条件下におけるキサンテン色素の指紋（fingerprint、ＦＰ）領域の振動が比較的シャープなｓｉｎｇｌｅピークとして検出できることを見出した。さらに、１０位元素の置換を行った誘導体間で当該ピークのラマンシフト値が大きく変化することが実測・計算スペクトルから明らかとなった。以上のことから、１０位元素の置換などの構造展開によって、異なるｒｈｏｄａｍｉｎｅ類をＦＰ領域で分離検出可能であることが示唆された。
【０００８】
本発明者らは、これらの知見も勘案して、新規ＧＳＨ定量型ラマンプローブの開発をするために検討したところ、ローダミン骨格の３，６位のＮ原子上の置換基や９位のベンゼン環上の置換基の構造展開によって最適な吸収波長、ＧＳＨ応答性を有する色素母核を得ることができるのではないかと着想して、鋭意検討した結果、ＧＳＨ応答性のローダミン誘導体とＧＳＨ非応答性のローダミン誘導体を開発することができ、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は以下の構成を有するものである。
［１］－ＳＨ基を含有する化合物を検出する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、－ＳＨ基を含有する化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が－ＳＨ基を含有する化合物と反応することにより変化するラマン散乱光を測定する工程
を含む、当該方法。
TIFF
2024126464000001.tif
55
150
（式中、
Ｒ
１
は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ
２
及びＲ
３
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
４
及びＲ
５
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
６
及びＲ
７
は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ
８
及びＲ
９
は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒ
ａ
）（Ｒ
ｂ
）、Ｃ（Ｒ
ａ
）（Ｒ
ｂ
）又はＰ（＝Ｏ）Ｒ
ｃ
から選択され、
ここで、Ｒ
ａ
及びＲ
ｂ
は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
Ｒ
ｃ
は、炭素数１～６個の置換又は無置換のアルキル基、又は置換又は無置換のフェニル基である。）
［２］Ｒ
１
の一価の置換基は、芳香族環における２位又は６位の位置に置換基を有しないか、あるいは、２位及び６位の位置に置換基を有しない、［１］に記載の方法。
［３］Ｒ
１
の一価の置換基は、ベンゼン環における２位及び６位の位置に置換基を有しない、［２］に記載の方法。
［４］一般式（Ｉ）のキサンテン骨格の３位、６位の窒素原子の少なくとも一方の窒素原子上で環構造が形成されている、［１］～［３］のいずれか１項に記載の検出方法。
［５］（ａ）の工程において、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩、及び－ＳＨ基を含有する化合物を接触させる、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
TIFF
2024126464000002.tif
46
148
（式中、
Ｒ
１
は、芳香族環上に任意に存在する一価の置換基を表し、当該一価の置換基が２以上存在する場合は、同一又は異なっていてもよく；
Ｒ
２
及びＲ
３
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
４
及びＲ
５
は、それぞれ独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子であり；
Ｒ
６
及びＲ
７
は、それぞれ独立に、水素原子、又は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、新規な－ＳＨ基含有化合物検出型ラマンプローブを提供することが可能である。
また、本発明により、－ＳＨ基含有化合物、例えばグルタチオン（ＧＳＨ）応答性のローダミン誘導体とＧＳＨ非応答性のローダミン誘導体とを併用することにより、グルタチオンの濃度を定量的に検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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