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公開番号2024101078
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-07-29
出願番号2023004767
出願日2023-01-17
発明の名称アデノ随伴ウイルス吸着剤の洗浄方法
出願人東ソー株式会社
代理人
主分類C07K 1/22 20060101AFI20240722BHJP(有機化学)
要約【課題】不溶性担体と当該担体に固定化したアデノ随伴ウイルス(AAV)結合性タンパク質とを含むAAV吸着剤を、AAVの分離性能を保持しながら洗浄可能な方法を提供すること。
【解決手段】 AAV吸着剤の洗浄に用いる洗浄液として、界面活性剤を含む緩衝液を用いることで、前記課題を解決する。
【選択図】図3
特許請求の範囲【請求項１】
不溶性担体と当該担体に固定化したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤を洗浄する方法であって、前記洗浄に用いる洗浄液が界面活性剤を含む緩衝液である、前記方法。
続きを表示（約 650 文字）【請求項２】
ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項１に記載の方法；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつアデノ随伴ウイルス結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつアデノ随伴ウイルス結合活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
ＡＡＶ吸着剤にＡＡＶを含む試料を添加し当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤を請求項１または２に記載の方法で洗浄する工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを、界面活性剤を含む溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、ＡＡＶの精製方法。
【請求項４】
ＡＡＶ吸着剤がカラムに充填した態様である、請求項３に記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）吸着剤の洗浄方法に関する。特に本発明は、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤の洗浄方法に関する。
続きを表示（約 1,600 文字）【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に分類される非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ外殻粒子は３種類のタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成されており、約６０のタンパク質分子がおよそＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０の比率で混在し集合することで、直径２０ｎｍから３０ｎｍの正二十面体の形状をしている。
【０００３】
自然界でのＡＡＶは自立性の増殖能を欠き、複製はアデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスに依存する。前記ヘルパーウイルスが存在すると、ＡＡＶゲノムは宿主細胞内で複製され、ＡＡＶゲノムを含む完全なＡＡＶ粒子が形成され、宿主細胞からＡＡＶ粒子が放出される。一方、前記ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶゲノムはエピソームに維持された状態または宿主染色体に組込まれた状態（潜伏状態）となる。
【０００４】
ＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること、などから、先天性遺伝子疾患の治療を目的とした遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が注目されている。
【０００５】
遺伝子組換えＡＡＶベクター（以下、単にＡＡＶベクターとも表記）の製造は、通常、ＡＡＶ粒子形成に必須な要素をコードする核酸を細胞に導入することで、ＡＡＶを産生する能力を有する細胞（以下、ＡＡＶ産生細胞とも表記）を作製し、当該細胞を培養してＡＡＶ粒子形成に必須な要素を発現させることで行なう。製造したＡＡＶベクターはＡＡＶ産生細胞から回収精製し、治療用ＡＡＶベクター製剤を得る。
【０００６】
ＡＡＶベクターの精製にあたっては、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤を用いたアフィニティクロマトグラフィによる方法が知られている（特許文献１および２、ならびに非特許文献１）。当該方法では前記吸着剤を充填したカラムの態様で利用しているが、利用後に当該カラム内の残存成分が前記吸着剤に非特異吸着した場合、当該成分が堆積することで当該カラムの劣化を早める原因となり得る。劣化した前記カラムで精製して製造した治療用ＡＡＶベクター製剤は、薬効の低下による治療効果の減少や、重篤な副作用の誘因につながる可能性を有している。したがって、高品質な治療用ＡＡＶベクター製剤を製造するには、前記カラムの分離性能が保持されるよう、適切な方法で洗浄することが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
特表２０１８－５０７７０７号公報
ＷＯ２０２１／１０６８８２号
【非特許文献】
【０００８】
ＧｅｒａｒｄＡｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ，３６，２９（２０１９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、不溶性担体と当該担体に固定化したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤を、ＡＡＶの分離性能を保持しながら洗浄可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、不溶性担体と当該担体に固定化したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤の洗浄に、界面活性剤を含む緩衝液を用いることで前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
（【００１１】以降は省略されています）

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