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公開番号2025158948
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-17
出願番号2025061489
出願日2025-04-02
発明の名称脂質スクランブル活性の調節物質のスクリーニング方法
出願人国立大学法人京都大学
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/02 20060101AFI20251009BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明は、細胞膜上における新たなPLSシステムに基づき、PLS活性の調節物質又はPLS活性異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニング系、及びPLS活性異常を伴う疾患の診断法を提供することである。
【解決手段】Tmem63bにより誘導される脂質スクランブル活性の調節物質のスクリーニング方法であって、次の工程:(1)前記Tmem63b、Slc19a2、及びKcnn4を発現する細胞と、前記調節物質の候補物質とを、Ca²⁺刺激下で接触させる工程;(2)前記候補物質による、前記細胞の細胞膜における脂質スクランブル活性の変化の有無を決定する工程;及び(3)前記変化をもたらした前記候補物質を、前記調節物質として選択する工程;を含む、スクリーニング方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｔｍｅｍ６３ｂにより誘導される脂質スクランブル活性の調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）前記Ｔｍｅｍ６３ｂ、Ｓｌｃ１９ａ２、及びＫｃｎｎ４を発現する細胞と、前記調節物質の候補物質とを、Ｃａ
2+
刺激下で接触させる工程；
（２）前記候補物質による、前記細胞の細胞膜における脂質スクランブル活性の変化の有無を決定する工程；及び
（３）前記変化をもたらした前記候補物質を、前記調節物質として選択する工程；
を含む、スクリーニング方法。
続きを表示（約 1,500 文字）【請求項２】
前記工程（３）において、前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して低い場合、前記候補物質を、前記脂質スクランブル活性を阻害する調節物質として選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（３）において、前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して高い場合、前記候補物質を、前記脂質スクランブル活性を促進する調節物質として選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（２）において、前記脂質スクランブル活性を、前記Ｔｍｅｍ６３ｂと前記Ｓｌｃ１９ａ２とのヘテロダイマーの量に基づいて測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（２）において、前記脂質スクランブル活性を、細胞膜の外側に位置するリン脂質又は糖脂質の取込み活性、及び細胞膜の内側に位置するリン脂質の露出活性の少なくともいずれかに基づいて測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）変異Ｔｍｅｍ６３ｂ及びＳｌｃ１９ａ２を発現する細胞と、前記治療薬の候補物質とを、Ｃａ
2+
非刺激下で接触させる工程；
（２）前記候補物質による、前記細胞の細胞膜における脂質スクランブル活性の低下の有無を決定する工程；及び
（３）前記低下をもたらした前記候補物質を、前記治療薬として選択する工程；
を含み、
前記変異Ｔｍｅｍ６３ｂが、
［Ａ－i］配列番号１に示すアミノ酸配列において、第４４位アミノ酸残基のメチオニン残基への置換、第４５９位アミノ酸残基のグルタミン酸残基への置換、第４７５位アミノ酸残基の欠失、及び第６６０位アミノ酸残基のトレオニン残基への置換の少なくともいずれかの変異を持つアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［Ａ－ii］前記［Ａ－i］に示すポリペプチドのアミノ酸配列において、前記変異のアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、Ｓｌｃ１９ａ２とともに形成されるヘテロダイマーが、Ｃａ
2+
の刺激無しで細胞膜において脂質スクランブル活性を有するポリペプチド、並びに
［Ａ－iii］前記［Ａ－i］に示すポリペプチドのアミノ酸配列において、前記変異のアミノ酸残基を除いた部分の配列同一性が７５％以上のアミノ酸配列からなり、且つ、Ｓｌｃ１９ａ２とともに形成されるヘテロダイマーが、Ｃａ
2+
の刺激無しで細胞膜において脂質スクランブル活性を有するポリペプチド
の少なくともいずれかである、スクリーニング方法。
【請求項７】
前記疾患が、血液学的異常を伴う疾患及びてんかんからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記血液学的異常が、巨赤芽球性貧血又は溶血性貧血である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（２）において、前記脂質スクランブル活性を、前記Ｔｍｅｍ６３ｂ変異体と前記Ｓｌｃ１９ａ２とのヘテロダイマーの量に基づいて測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（２）において、前記脂質スクランブル活性を、細胞膜の外側に位置するリン脂質又は糖脂質の取込み活性、及び細胞膜の内側に位置するリン脂質の露出活性の少なくともいずれかに基づいて測定する、請求項６に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質スクランブル活性の調節物質のスクリーニング方法、脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニング方法、脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の罹患を試験する方法、及び脂質スクランブル活性異常を伴う疾患における重症度を試験する方法に関する。
続きを表示（約 12,000 文字）【背景技術】
【０００２】
分子が膜を隔てて非対称に分布することは、環境の変化に適応するための細胞の基本的な性質である。例えば、脂質は細胞膜の脂質二重層で非対称に分布している。ホスファチジルセリン（ＰＳ）とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）は細胞膜の内側に限られ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）とスフィンゴミエリン（ＳＭ）は主に細胞膜の外層に位置している（非特許文献１～４）。しかしながら、生理的な状況によっては、細胞が周囲の環境の変化又は内在的手がかり（intrinsic cues）に反応する際に、脂質スクランブルによって当該非対称性が速やかに変化し、その結果、ＰＳを細胞表面に露出させる。露出したＰＳは、出血時に活性化血小板上の凝固因子の足場として機能する（非特許文献５）。細胞表面のＰＳはまた、死細胞が食細胞に飲み込まれるための「ｅａｔｍｅシグナル」としても機能する（非特許文献６～９）。
【０００３】
スクランブラーゼの分子的実体は何十年もの間不明であった。本発明者は、以前、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングを用い、ユビキタススクランブラーゼＴｍｅｍ１６ＦとＸｋｒ８を発見し、それぞれ凝固反応と死細胞のクリアランスにおいて脂質スクランブルを誘導することを明らかにした（非特許文献１０～１４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Nat. Rev. Mol. cell Biol. 9, 112-124 (2008).
Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
Front. Physiol. 7,275(2016).
Cell. Mol. Life Sci. CMLS 63,2908-2921 (2006).
Cell. Mol. Life Sci. CMLS 62,971-988 (2005).
J. Exp. Med. 207, 1807-1817 (2010).
Physiol. Rev. 96,605-645 (2016).
Annu. Rev. Immunol. 36,489-517 (2018).
Neurosci. Res. https://doi.org/10.1016/j.neures.2021.01. 003 (2021).
Nature 468, 834-838 (2010).
J. Biol. Chem. 288, 13305-13316 (2013).
Science 341,403-406 (2013).
J. Biol. Chem. 289,30257-30267 (2014).
Proc. Natl Acad. Sci. USA 113,9509-9514 (2016).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、Ｂａ／Ｆ３細胞（プロＢ細胞株）においてＴｍｅｍ１６ＦとＸｋｒ８とが欠損していても、高Ｃａ
2+
イオノフォア刺激下で脂質スクランブルが依然として誘導される。これは、細胞膜上に他の脂質スクランブルシステムが存在することを示唆する。このような脂質スクランブルシステムが見出されれば、当該脂質スクランブルシステムに基づくスクリーニング系の構築によって、脂質スクランブル活性の調節物質又は脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニングが可能になり、当該脂質スクランブルシステムにおける脂質スクランブル活性と関連する因子をマーカーとして利用することで、脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の診断（罹患又は重症度の試験）が可能になることが期待できる。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、細胞膜上における新たな脂質スクランブルシステムに基づき、脂質スクランブル活性の調節物質又は脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニング系、及び脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の診断法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は鋭意検討の結果、細胞膜上における新たな脂質スクランブルシステムとして、Ｔｍｅｍ６３ｂ／Ｓｌｃ１９ａ２誘導性の脂質スクランブル（図２ｅ［１］、図５ｉ）と、Ｓｔｉｍ１／Ｏｒａｉ１を介した脂質スクランブル（図２ｅ［２］）とを新たに見出した。このうち、Ｔｍｅｍ６３ｂ／Ｓｌｃ１９ａ２誘導性の脂質スクランブルにおいて、Ｔｍｅｍ６３ｂとＳｌｃ１９ａ２がヘテロダイマーを形成し、野生型のＴｍｅｍ６３ｂとＳｌｃ１９ａ２とのヘテロダイマーがＫｃｎｎ４の活性化を伴い脂質スクランブルを誘導すること（図５ｉ上）、及び所定の疾患関連変異型Ｔｍｅｍ６３ｂとＳｌｃ１９ａ２とのヘテロダイマーがＫｃｎｎ４の活性化を伴わずに脂質スクランブルを示すこと（図５ｉ下）を見出した。さらに、野生型のＴｍｅｍ６３ｂとＳｌｃ１９ａ２とのヘテロダイマー、及び所定の疾患関連変異型Ｔｍｅｍ６３ｂとＳｌｃ１９ａ２とのヘテロダイマーのいずれについても、ヘテロダイマー形成量と脂質スクランブル活性のレベルとの間に相関があることを見出した（図５ｆ、ｇ、及び図５ｈ）。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．Ｔｍｅｍ６３ｂにより誘導される脂質スクランブル活性の調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）前記Ｔｍｅｍ６３ｂ、Ｓｌｃ１９ａ２、及びＫｃｎｎ４を発現する細胞と、前記調節物質の候補物質とを、Ｃａ
2+
刺激下で接触させる工程；
（２）前記候補物質による、前記細胞の細胞膜における脂質スクランブル活性の変化の有無を決定する工程；及び
（３）前記変化をもたらした前記候補物質を、前記調節物質として選択する工程；
を含む、スクリーニング方法。
項２．前記工程（３）において、前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して低い場合、前記候補物質を、前記脂質スクランブル活性を阻害する調節物質として選択する、項１に記載の方法。
項３．前記工程（３）において、前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して高い場合、前記候補物質を、前記脂質スクランブル活性を促進する調節物質として選択する、項１に記載の方法。
項４．前記工程（２）において、前記脂質スクランブル活性を、前記Ｔｍｅｍ６３ｂと前記Ｓｌｃ１９ａ２とのヘテロダイマーの量に基づいて測定する、項１～３のいずれかに記載の方法。
項５．前記工程（２）において、前記脂質スクランブル活性を、細胞膜の外側に位置するリン脂質又は糖脂質の取込み活性、及び細胞膜の内側に位置するリン脂質の露出活性の少なくともいずれかに基づいて測定する、項１～３のいずれかに記載の方法。
項６．脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）変異Ｔｍｅｍ６３ｂ及びＳｌｃ１９ａ２を発現する細胞と、前記治療薬の候補物質とを、Ｃａ
2+
非刺激下で接触させる工程；
（２）前記候補物質による、前記細胞の細胞膜における脂質スクランブル活性の低下の有無を決定する工程；及び
（３）前記低下をもたらした前記候補物質を、前記治療薬として選択する工程；
を含み、
前記変異Ｔｍｅｍ６３ｂが、
［Ａ－i］配列番号１に示すアミノ酸配列において、第４４位アミノ酸残基のメチオニン残基への置換、第４５９位アミノ酸残基のグルタミン酸残基への置換、第４７５位アミノ酸残基の欠失、及び第６６０位アミノ酸残基のトレオニン残基への置換の少なくともいずれかの変異を持つアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［Ａ－ii］前記［Ａ－i］に示すポリペプチドのアミノ酸配列において、前記変異のアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、Ｓｌｃ１９ａ２とともに形成されるヘテロダイマーが、Ｃａ
2+
の刺激無しで細胞膜において脂質スクランブル活性を有するポリペプチド、並びに
［Ａ－iii］前記［Ａ－i］に示すポリペプチドのアミノ酸配列において、前記変異のアミノ酸残基を除いた部分の配列同一性が７５％以上のアミノ酸配列からなり、且つ、Ｓｌｃ１９ａ２とともに形成されるヘテロダイマーが、Ｃａ
2+
の刺激無しで細胞膜において脂質スクランブル活性を有するポリペプチド
の少なくともいずれかである、スクリーニング方法。
項７．前記疾患が、血液学的異常を伴う疾患及びてんかんからなる群より選択される、項６に記載の方法。
項８．前記血液学的異常が、巨赤芽球性貧血又は溶血性貧血である、項７に記載の方法。
項９．前記工程（２）において、前記脂質スクランブル活性を、前記Ｔｍｅｍ６３ｂ変異体と前記Ｓｌｃ１９ａ２とのヘテロダイマーの量に基づいて測定する、項６～８のいずれかに記載の方法。
項１０．前記工程（２）において、前記脂質スクランブル活性を、細胞膜の外側に位置するリン脂質又は糖脂質の取込み活性、及び細胞膜の内側に位置するリン脂質の露出活性の少なくともいずれかに基づいて測定する、項６～８のいずれかに記載の方法。
項１１．脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）変異Ｔｍｅｍ６３ｂ、Ｓｌｃ１９ａ２、及びＫｃｎｎ４を発現する細胞と、前記治療薬の候補物質とを、Ｃａ
2+
刺激下で接触させる工程；
（２）前記候補物質による、前記細胞の細胞膜における脂質スクランブル活性の増大の有無を決定する工程；及び
（３）前記増大をもたらした前記候補物質を、前記治療薬として選択する工程；
を含み、
前記変異Ｔｍｅｍ６３ｂが、
［Ｂ－i］配列番号１に示すアミノ酸配列において、第４３３位アミノ酸残基のヒスチジン残基への置換を持つアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［Ｂ－ii］前記［Ｂ－i］に示すポリペプチドのアミノ酸配列において、前記置換のアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、Ｓｌｃ１９ａ２とともに形成されるヘテロダイマーが、Ｃａ
2+
の刺激下で細胞膜において脂質スクランブル活性を有しないポリペプチド、並びに、
［Ｂ－iii］前記［Ｂ－i］に示すポリペプチドのアミノ酸配列において、前記置換のアミノ酸残基を除いた部分の配列同一性が７５％以上であり、且つ、Ｓｌｃ１９ａ２とともに形成されるヘテロダイマーが、Ｃａ
2+
の刺激下で細胞膜において脂質スクランブル活性を有しないポリペプチド
の少なくともいずれかである、スクリーニング方法。
項１２．前記疾患が、血液学的異常を伴う疾患及び難聴からなる群より選択される、項１１に記載の方法。
項１３．脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の罹患を試験する方法であって、以下の工程：
（１）試験対象に由来する細胞試料において、Ｃａ
2+
非刺激下での変異Ｔｍｅｍ６３ｂとＳｌｃ１９ａ２とのヘテロダイマーの定量値を得る工程；及び
（２）前記定量値を閾値と比較する工程
を含み、
前記変異Ｔｍｅｍ６３ｂが、
［Ａ－i］配列番号１に示すアミノ酸配列において、第４４位アミノ酸残基のメチオニン残基への置換、第４５９位アミノ酸残基のグルタミン酸残基への置換、第４７５位アミノ酸残基の欠失、及び第６６０位アミノ酸残基のトレオニン残基への置換の少なくともいずれかの変異を持つアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［Ａ－ii］前記［Ａ－i］に示すポリペプチドのアミノ酸配列において、前記変異のアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、Ｓｌｃ１９ａ２とともに形成されるヘテロダイマーが、Ｃａ
2+
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞膜上における新たな脂質スクランブルシステムに基づき、脂質スクランブル活性の調節物質又は脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニング系、及び脂質スクランブル活性異常を伴う疾患の診断法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
繰り返し選別による高ＰＬＳ（リン脂質スクランブル）細胞の確立（図１ａ～図１ｄ）。ＰＬＳ活性の解析。ＰＬＳ活性は、Ｂａ／Ｆ３細胞及びＴｍｅｍ１６ＦとＸｋｒ８を欠損した細胞（ＢＤＫＯ細胞）のＮＢＤ－ＰＣ取り込みアッセイを用いて調べた。細胞をＬｉｐｉｄ緩衝液（１ｍＭのＣａＣｌ
2
と１ｍＭのＭｇＣｌ
2
を含んだＨＢＳＳ）に再懸濁し、低濃度のカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（０．５μＭ）及び高濃度のＡ２３１８７（３．０μＭ）で４℃にて刺激し、０分後（薄灰色）及び１０分後（濃灰色）に解析した。バーはホスファチジルコリン（ＰＣ）取り込み陽性領域、数値はバー内の細胞集団。実験は独立して３回行い、代表的なデータを示す。
高ＰＬＳ細胞の構築戦略。Ｌｉｐｉｄ緩衝液中、Ａ２３１８７（０．５μＭ）で刺激したとき、高いＮＢＤ－ＰＣ取り込み活性を示したＢＤＫＯ細胞をフローサイトメトリーで回収し、その後増殖させた。高ＰＬＳ細胞（ｈＰＣ１９）は、１９回のソーティングを繰り返すことにより得られた。
ｈＰＣ１９細胞中のＰＣ取り込みアッセイ。ｈＰＣ１９細胞をＬｉｐｉｄ緩衝液中、低濃度のＡ２３１８７（０．５μＭ）及び高濃度のＡ２３１８７（３．０μＭ）で４℃にて刺激し、０分後（薄灰色）と１０分後（濃灰色）に解析した。バーはＰＣ取り込み陽性領域、数値はバー内の細胞集団。
ホスファチジルセリン（ＰＳ）露出活性。親ＢＤＫＯ細胞とｈＰＣ１９細胞を、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）を含んだＡｎｎｅｘｉｎ緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ
2
）中で、３．０μＭのＡ２３１８７で室温にて１０分間刺激した。ＰＩ陰性領域を示す。実験は独立して３回行い、代表的なデータを示す。
ＰＬＳ誘導タンパク質としてのＴｍｅｍ６３ｂの同定（図２ａ～図２ｅ）。ｓｇＲＮＡライブラリーを用いたリバイバルスクリーニングの模式図。ｓｇＲＮＡライブラリーをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を発現するｈＰＣ１９細胞に導入した。ＮＢＤ－ＰＣアッセイを行った際、細胞をＬｉｐｉｄ緩衝液中で、３．０μＭのＡ２３１８７で４℃にて１０分間刺激し、ＰＣ取り込み陰性領域をフローサイトメトリーで選別した。選別された細胞からゲノムＤＮＡを精製し、ＰＣＲを行って統合ｓｇＲＮＡ領域を増幅し、濃縮ｓｇＲＮＡライブラリーを再構築するために、レンチウイルスベクターに挿入した。新たに再構築されたライブラリーは、次のスクリーニングに使用した。これらのプロセスを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために３回繰り返した。
リバイバルスクリーニング。ＰＣ取り込み陰性細胞（１％）をフローサイトメトリーで選別し、ｓｇＲＮＡライブラリーの再構築に用いた。ｓｇＰＣ０は元のｓｇＲＮＡライブラリーを導入した細胞、ｓｇＰＣ２は２回ソートした細胞、ｓｇＰＣ３は３回ソートした細胞。バーはＰＣ取り込み陰性領域、数字はバー内の細胞集団。
４回目のソーティング後のｓｇＲＮＡのＮＧＳ解析。総リード数（同一遺伝子に対する異なるｓｇＲＮＡからのリードの合計）をランク付けした。マッピングされた数字は、６種類のｓｇＲＮＡのうち、同定されたｓｇＲＮＡ標的の数を示す。マップ番号０～２はリストから除外した。さらに解析した遺伝子には下線を付している。
ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩ染色によるＰＬＳ活性は、コントロールとしてＢＤＫＯ細胞中で行い、Ｓｔｉｍ１ノックアウト（ＫＯ）ＢＤＫＯ細胞及びＳｔｉｍ１で修復した細胞、Ｔｍｅｍ６３ｂＫＯＢＤＫＯ細胞、及びＴｍｅｍ６３ｂで修復した細胞を、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩを含んだＡｎｎｅｘｉｎ緩衝液中で、３．０μＭのＡ２３１８７で室温にて１０分間刺激した。ＰＩ陰性領域を解析した。実験は独立して３回行い、代表的なデータを示す。
ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩ染色によるＰＬＳ活性は、コントロールとしてＢＤＫＯ細胞中で行い、Ｓｔｉｍ１／Ｔｍｅｍ６３ｂ二重ＫＯＢＤＫＯ細胞、及びＴｍｅｍ６３ｂ又はＳｔｉｍ１で修復した細胞を、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩを含んだＡｎｎｅｘｉｎ緩衝液中で、３．０μＭのＡ２３１８７で室温にて１０分間刺激した。ＰＩ陰性領域を解析した。実験は独立して３回行い、代表的なデータを示す。
２つの独立したＣａ
2+
介在ＰＬＳ系のモデル。［１］は、ＰＭにおけるＴｍｅｍ６３ｂ依存性ＰＬＳ。［２］は、ＥＲＰＭ接触部位でのＳｔｉｍ１／Ｏｒａｉ１依存性ＰＬＳ。ｅｐＳＣＲは、未知のＥＲ－ＰＭスクランブラーゼ。
Ｔｍｅｍ６３ｂ変異体を介したＰＬＳ（図３ａ～図３ｅ）。Ｔｍｅｍ６３ｂと脊椎動物種５種のオルソログの多重整列（ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＮＰ＿００１３０５７２１．１；ＭｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓＮＰ＿９３７８１０．２；ＧａｌｌｕｓｇａｌｌｕｓＮＰ＿００１３６６１７０．１；ＸｅｎｏｐｕｓｔｒｏｐｉｃａｌｉｓＸＰ＿０３１７５７９０５．１；ＤａｎｉｏｒｅｒｉｏＮＰ＿００１３１３３３６．１）。変異残基を太字で示した。配列の下のアスタリスク（*）は、アミノ酸が異なる種間で保存されている位置を示し、コロン（：）は、類似のアミノ酸が異なる種間で保存されていることを示している。
ヒトＴＭＥＭ６３Ｂタンパク質の模式図と構造（ｐｄｂ：８ｅｈｘ）上の同定された疾患変異体（Ｖ４４Ｍ、Ｒ４３３Ｈ、Ｄ４５９Ｅ、Ｉ４７５ｄｅｌ、Ｒ６６０Ｔ）の位置。アスタリスク（*）は変異の位置。
ＰＳ露出アッセイ。Ｔｍｅｍ６３ｂＷＴ発現又はＴｍｅｍ６３ｂ変異体発現細胞を、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩを含んだＡｎｎｅｘｉｎ緩衝液中、３．０μＭのＡ２３１８７で刺激し（（＋）Ａ２３１８７）、又はＡ２３１８７なしで刺激し（（－）Ａ２３１８７）、４℃にて１０分間インキュベートした。バーはＰＳ露出陽性領域、数値はバー内の細胞集団。Ｔｍｅｍ６３ｂ変異体のデータは、活性の強さに従って表示した。
ＰＳ露出の定量化。図３ｃのＡ２３１８７刺激なしのＴｍｅｍ６３ｂ変異体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、３反復の平均値として示した（ｎ＝３、独立した実験）。中央、下、上の線はそれぞれ中央値、最小値、最大値を示す。Ｔｍｅｍ６３ｂ変異体のデータは、活性の強さに従って表示した。ソースデータはＳｏｕｒｃｅＤａｔａファイルとして提供されている。
骨髄単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ｎ＝９、異なるＢＭサンプル、ｋ＝１０３，２２８、妊娠１２～１９週（ＰＣＷ））のヒト胎児骨髄単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータの均一多様体近似と射影（ＵＭＡＰ）をデータベースＥ－ＭＴＡＢ－９３８９から取得し、大まかなカテゴリー別に解析した。Ｂａｓｏｂａｓｏｐｈｉｌ；ｅｏｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ；ＭＫｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ。ＴＭＥＭ６３Ｂは赤血球系で発現し、特に中期及び後期赤血球で高発現している。
Ｔｍｅｍ６３ｂを介したＰＬＳの活性化因子の同定（図４ａ～図４ｈ）。リバイバルスクリーニング。Ｔｍｅｍ６３ｂ－ＧＦＰ発現ＢＤＫＯ細胞を、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩを含んだＡｎｎｅｘｉｎ緩衝液中、３．０μＭのＡ２３１８７で４℃にて１時間刺激し、フローサイトメトリーを行い、ＧＦＰ陽性集団の中からＰＳ露出陰性細胞を回収し、濃縮されたｓｇＲＮＡライブラリーの再構築に使用した。ｓｇＰＣ０は、元のｓｇＲＮＡライブラリーを導入した細胞を指し、ｓｇＰＣ３は、３回ソーティングした細胞を指す。バーはＰＳ露出陰性領域、数値はバー内の細胞集団。
４回ソーティング後のＮＧＳ解析。総リード数（同一遺伝子に対する異なるｓｇＲＮＡからのリード数の合計）をランク付けした。マッピングされた数値は、６種類の異なるｓｇＲＮＡのうち、同定されたｓｇＲＮＡ標的の数値を示す。マッピングされた数値が０から２までのものはリストから除外した。さらに解析された遺伝子には下線を付している。
ＰＳ露出アッセイ。Ｔｍｅｍ６３ｂ－ＧＦＰ発現ＢＤＫＯ細胞、ｓｇＫｃｎｎ４発現細胞、ならびにｓｇＫｃｎｎ４及びＫｃｎｎ４ＷＴ－ｔａｇＲＦＰの両方を発現する細胞を、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩを含んだＡｎｎｅｘｉｎ緩衝液中で３μＭのＡ２３１８７で刺激した。フローサイトメトリー解析は１０分間隔で行った。ＰＩ陰性細胞を解析した。３回（ｎ＝３、独立した実験）の平均値をエラーバーとともに示す。データは平均値±ＳＥＭとして提示する。ソースデータはＳｏｕｒｃｅｄａｔａファイルとして提供されている。
ＰＳ露出アッセイ。Ｔｍｅｍ６３ｂ－ＧＦＰ発現ＢＤＫＯ細胞、ｓｇＳｌｃ１９ａ２発現細胞、ならびにｓｇＳｌｃ１９ａ２及びＳｌｃ１９ａ２ＷＴ－ｔａｇＲＦＰ又はＳ１４３Ｆ－ｔａｇＲＦＰの両方を発現する細胞を、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩを含んだＡｎｎｅｘｉｎ緩衝液中で３．０μＭのＡ２３１８７で４℃にて刺激した。フローサイトメトリー解析は１０分ごとに実施した。ＰＩ陰性細胞を示す。３回（ｎ＝３、独立した実験）の平均値をエラーバーとともに示す。データは平均値±ＳＥＭとして提示する。ソースデータはＳｏｕｒｃｅｄａｔａファイルとして提供されている。
図４ｃと図４ｄとの比較。４０分のＰＳ露出の平均値を示す。データは平均値±ＳＥＭで提示する。統計解析は、スチューデントのｔ検定の両側検定を用いて行った。ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ソースデータはＳｏｕｒｃｅＤａｔａファイルとして提供されている。
ＰＳ露出アッセイ。Ｔｍｅｍ６３ｂ変異体－ＧＦＰ発現細胞を、Ｓｌｃ１９ａ２－ｔａｇＲＦＰ又はｓｇＳｌｃ１９ａ２、及びＫｃｎｎ４－ｔａｇＲＦＰ又はｓｇＫｃｎｎ４とともに、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩを含んだＡｎｎｅｘｉｎ緩衝液中で４℃にて１０分間、Ａ２３１８７刺激なしでインキュベートした。
図４ｆの定量化。実験はそれぞれ独立して３回行い、ＰＳ露出の平均値をエラーバーとともに示す。データは平均値±ＳＥＭとして提示する。統計解析は、スチューデントのｔ検定の両側検定を用いて行った。ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｔｍｅｍ６３ｂ変異体とｓｇＲＮＡの両方を発現する細胞の列は網掛けした。ソースデータはＳｏｕｒｃｅＤａｔａファイルとして提供されている。
図４ｆの定量化。実験はそれぞれ独立して３回行い、ＰＳ露出の平均値をエラーバーとともに示す。データは平均値±ＳＥＭとして提示する。統計解析は、スチューデントのｔ検定の両側検定を用いて行った。ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｔｍｅｍ６３ｂ変異体とｓｇＲＮＡの両方を発現する細胞の列は網掛けした。ソースデータはＳｏｕｒｃｅＤａｔａファイルとして提供されている。
Ｔｍｅｍ６３ＢとＳｌｃ１９ａ２はヘテロダイマーを形成する（図５ａ～図５ｉ）。Ｔｍｅｍ６３ｂＧＦＰ発現ＢＤＫＯ細胞の溶解液のＢＮ－ＰＡＧＥ解析。Ｔｍｅｍ６３ｂは主にモノマーとして存在し、わずかにダイマー様状態としても存在する。抗ＧＦＰを用いてＴｍｅｍ６３ｂを検出した。実験は独立して３回行い、代表的なデータを示す。
Ｔｍｅｍ６３ｂ相互作用分子。Ｔｍｅｍ６３ｂＧＦＰ発現細胞をＬＭＮＧ／ＣＨＳで可溶化し、抗ＧＦＰナノボディ結合ビーズを用いた免疫沈降に供し、その後質量分析を行った。ｘ軸は、Ｃａ
2+
非存在下におけるＴｍｅｍ６３ｂと親細胞との間のフォールド変化（ｌｏｇ２）で示した存在比を示し、ｙ軸は、Ｃａ
2+
存在下におけるＴｍｅｍ６３ｂと親細胞との間のフォールド変化（ｌｏｇ２）で示した存在比を示す。矢印で指し示したドットは、Ｔｍｅｍ６３ｂとＳｌｃ１９ａ２を示す。
Ｓｌｃ１９ａ２－ｔａｇＲＦＰ、Ｋｃｎｎ４－ｔａｇＲＦＰ、及びＣｓｎｋ２ｂ－ｔａｇＲＦＰの過剰発現、又はｓｇＳｌｃ１９ａ２、ｓｇＫｃｎｎ４、及びｓｇＣｓｎｋ２ｂの導入によるＴｍｅｍ６３ｂ発現細胞のＢＮ－ＰＡＧＥ解析。抗ＧＦＰ抗体を用いてＴｍｅｍ６３ｂを検出した。実験は３回独立して行い、代表的なデータを示す。
Ｓｌｃ１９ａ２－ＨＡ－ｔａｇＲＦＰの過剰発現におけるＴｍｅｍ６３ｂ－ＦＬＡＧ－ＧＦＰ発現細胞のＢＮ－ＰＡＧＥ解析。界面活性剤による可溶化後、細胞溶解液を抗ＦＬＡＧ又は抗ＨＡ抗体と混合し、ゲルシフトを観察するためにＢＮ－ＰＡＧＥに供した。（i）はモノマー、（ii）はヘテロダイマー、（iii）は抗体と結合したモノマー、（iv）は抗体と結合したヘテロダイマーを示す。抗ＧＦＰはＴｍｅｍ６３ｂの検出に使用した。実験は２回行い、代表的なデータを示す。
Ｔｍｅｍ６３ｂ変異体発現細胞のＢＮ－ＰＡＧＥ解析。抗ＧＦＰを用いてＴｍｅｍ６３ｂを検出した。実験は３回独立して行い、代表的なデータを示す。
Ｓｌｃ１９ａ２ＷＴ－ｔａｇＲＦＰの過剰発現におけるＴｍｅｍ６３ｂ変異体発現細胞のＢＮ－ＰＡＧＥ解析。抗ＧＦＰ抗体を用いてＴｍｅｍ６３ｂを検出した。実験は３回独立して行い、代表的なデータを示す。
Ｓｌｃ１９ａ２Ｓ１４３Ｆ－ｔａｇＲＦＰの過剰発現におけるＴｍｅｍ６３ｂ変異体発現細胞のＢＮ－ＰＡＧＥ解析。抗ＧＦＰを用いてＴｍｅｍ６３ｂを検出した。
１ｍＭのＣａＣｌ
2
又は０．５ｍＭのＥＧＴＡの存在下におけるＳｌｃ１９ａ２ＷＴ－ｔａｇＲＦＰ又はＳ１４３Ｆ－ｔａｇＲＦＰの過剰発現におけるＴｍｅｍ６３ｂ発現細胞のＢＮ－ＰＡＧＥ解析。抗ＧＦＰを用いてＴｍｅｍ６３ｂを検出した。実験は２回独立して行い、代表的なデータを示す。
Ｔｍｅｍ６３ｂ／Ｓｌｃ１９ａ２が介したＰＬＳの概略モデル。活性化状態では、Ｃａ
2+
刺激によりＴｍｅｍ６３ｂ／Ｓｌｃ１９ａ２ヘテロダイマーが介したＰＬＳが誘導され、Ｋｃｎｎ４が活性化される（上）。Ｔｍｅｍ６３ｂ変異体発現細胞では、Ｃａ
2+
刺激やＫ
+
流出がなくても持続的なＰＬＳが起こる（下）。
Ｓｔｉｍ１とＴｍｅｍ６３ｂ依存性ＰＬＳ（図６ａ～図６ｅ）。Ｓｔｉｍ１
-/-
ＢＤＫＯシングルクローンの塩基配列解析。ｓｇＲＮＡ標的領域をＰＣＲで増幅し、塩基配列を決定した。Ｓｔｉｍ１
(-/-)
の配列（上）。
Ｔｍｅｍ６３ｂ
-/-
ＢＤＫＯシングルクローンの塩基配列解析。ｓｇＲＮＡ標的領域をＰＣＲで増幅し、塩基配列を決定した。Ｔｍｅｍ６３ｂ
(-/-)
の配列（上）。
Ｃａ
2+
流入アッセイ。ＢＤＫＯ細胞を培養液中１ＭＦｌｕｏ４－ＡＭと３７℃で３０インキュベートし、Ａｎｎｅｘｉｎ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＣａＣｌ
2
）中３．０ＭＡ２３１８７とＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩで１００秒間刺激し、フローサイトメトリーにより室温で合計２００秒間記録した。実験は独立して３回行い、代表的なデータを示した。
ＰＳ暴露アッセイ。ＧＦＰと融合したＴｍｅｍ６３ファミリーメンバー（Ｔｍｅｍ６３ａ－ＧＦＰ、Ｔｍｅｍ６３ｂ－ＧＦＰ、又はＴｍｅｍ６３ｃ－ＧＦＰ）を発現するＳｔｉｍ１
-/-
ＢＤＫＯ細胞を、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５とＰＩの存在下、室温で３．０μＭＡ２３１８７で刺激した。ＰＩ陰性領域を解析した。Ｓｔｉｍ１
-/-
のデータは図２ｄと同じである。実験は独立して３回行い、代表的なデータを示した。
ＰＣ取り込みアッセイ。Ｓｔｉｍ１
-/-
Ｔｍｅｍ６３ｂ
-/-
ＢＤＫＯ細胞にＴｍｅｍ６３ｂ－ｔａｇＲＦＰ又はＳｔｉｍ１－ｔａｇＲＦＰを導入し、Ｌｉｐｉｄｂｕｆｆｅｒ（ＨＢＳＳと１ｍＭＣａＣｌ
2
及び１ｍＭＭｇＣｌ
2
を含む）中でＮＢＤ－ＰＣ取り込みアッセイを行った。バーはＰＣ取り込み陽性領域、数字はバー内の細胞集団。実験は独立して３回行い、代表的なデータを示した。
ＰＳ暴露アッセイ。ＢＤＫＯ細胞及びＴｍｅｍ６３ｂ－ＧＦＰを発現している細胞を、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｃｙ５／ＰＩを含むＡｎｎｅｘｉｎ緩衝液中で、３．０ＭＡ２３１８７の添加又は非添加で４℃で刺激した。フローサイトメトリー分析は１０分ごとに行った。ＰＩ陰性細胞の解析も行った。実験は別々に２回行い、代表的なデータを示した。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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