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公開番号2025131165
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-09-09
出願番号2024028719
出願日2024-02-28
発明の名称BRG1遺伝子を標的とした膵癌治療剤
出願人国立大学法人京都大学
代理人個人,個人
主分類A61K 48/00 20060101AFI20250902BHJP(医学または獣医学;衛生学)
要約【課題】膵癌の治療に有用な新規なアプローチを開発すること。
【解決手段】BRG1遺伝子発現を阻害するための、BRG1遺伝子を標的とする核酸、及び/又はBRG1遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む、膵癌細胞の増殖又は転移を抑制するための医薬組成物、膵癌治療のための医薬組成物、核酸分子、キットなどが提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ＢＲＧ１遺伝子発現を阻害するための、ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸、及び／又はＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む、
膵癌細胞の増殖又は転移を抑制するための医薬組成物。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸、及びＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸が、ＢＲＧ１遺伝子配列の一部に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ又は該ＲＮＡをコードする核酸であり、
前記ＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、医薬組成物。
【請求項３】
前記ＢＲＧ１遺伝子配列の一部に相補的な配列が、配列番号１又は配列番号２に示されるヌクレオチド配列又はその相補的配列である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記配列特異的ヌクレアーゼが、ＢＲＧ１遺伝子のゲノム配列の一部に特異的に結合するタンパク質とヌクレアーゼとの融合タンパク質である、医薬組成物。
【請求項６】
ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸を含む請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸が、ＢＲＧ１遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部に相補的な配列を含む核酸であって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は該ＲＮＡを生じさせる核酸、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される、医薬組成物。
【請求項７】
膵癌の治療用である、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ベクターを含む医薬組成物であって、前記ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸、及び／又は前記ＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸が前記ベクター中に含まれる、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
膵癌の治療用である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＢＲＧ１遺伝子配列の一部に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードする核酸、及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を含む、核酸分子。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵癌細胞の増殖及び転移抑制、並びに膵癌の治療に関する。
続きを表示（約 6,900 文字）【背景技術】
【０００２】
膵癌は、癌関連死の４番目に多い死因である。膵癌患者の５年生存率は１０％以下であり、遠隔転移患者ではさらに低い。膵癌は発見されにくく、自覚症状をきっかけに医師の診断を受けたときには癌のステージが進行していることが多い。また、現在のところ、膵癌の効果的な治療法は限定的であり、また、膵癌の膵臓から全身への転移を抑制する効果的な治療法も見出されていない。したがって、膵癌に対する新規治療法が早急に必要とされている。
【０００３】
ＡＴＰ依存性クロマチンリモデリング複合体は、ＡＴＰの加水分解により生じるエネルギーを用いてクロマチン構造を変化させ、それによりＤＮＡ結合因子にアクセス可能にすることによって遺伝子発現を制御する、エピジェネティックな調節因子の一群である。ＢＲＧ１(Brahma-Related Gene-1）は、ＡＴＰ依存性クロマチンリモデリング複合体の主要なファミリーであるＳＷＩ／ＳＮＦ（Switch/sucrose non-fermenting）複合体のＡＴＰａｓｅ触媒サブユニットである。発明者らは以前に、膵癌の前駆病変である膵上皮内腫瘍性病変（ＰａｎＩＮ（pancreatic intraepithelial neoplasia））の形成及びその維持にＢｒｇ１が必要とされることを報告した（非特許文献１）。しかしながら、既に形成されている膵癌の進行及び転移におけるＢｒｇ１の機能的役割はいまだ不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
J Clin Invest., 2018； 128：3475-89
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、膵癌の治療に有用な新規なアプローチを開発することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記のような情況下、発明者らは鋭意研究した結果、驚くべきことに、ＢＲＧ１遺伝子を標的とすることによって膵癌細胞の増殖及び転移を抑制でき、さらには膵癌細胞の細胞死（アポトーシス）を誘導できることを見出した。かくして、本発明が完成された。
【０００７】
本発明は、以下の態様を提供する。
［１］ＢＲＧ１遺伝子発現を阻害するための、ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸、及び／又はＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む、
膵癌細胞の増殖又は転移を抑制するための医薬組成物。
［２］ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸、及びＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む［１］に記載の医薬組成物であって、
前記ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸が、ＢＲＧ１遺伝子配列の一部に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ又は該ＲＮＡをコードする核酸であり、
前記ＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、医薬組成物。
［３］前記ＢＲＧ１遺伝子配列の一部に相補的な配列が、配列番号１又は配列番号２に示されるヌクレオチド配列又はその相補的配列である、［２］に記載の医薬組成物。
［４］前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、［２］又は［３］に記載の医薬組成物。
［５］ＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む［１］に記載の医薬組成物であって、
前記配列特異的ヌクレアーゼが、ＢＲＧ１遺伝子のゲノム配列の一部に特異的に結合するタンパク質とヌクレアーゼとの融合タンパク質である、医薬組成物。
［６］前記融合タンパク質がＺＦＮまたはＴＡＬＥＮである、［５］に記載の医薬組成物、
［７］ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸を含む［１］に記載の医薬組成物であって、
前記ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸が、ＢＲＧ１遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部に相補的な配列を含む核酸であって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は該ＲＮＡを生じさせる核酸、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される、医薬組成物。
［８］膵癌の治療用である、［１］～［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［９］ベクターを含む医薬組成物であって、前記ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸、及び／又は前記ＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸が前記ベクター中に含まれる、［１］～［８］のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［１０］ＢＲＧ１遺伝子配列の一部に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードする核酸、及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を含む、核酸分子。
［１１］前記ガイドＲＮＡが、配列番号１又は配列番号２に示されるヌクレオチド配列又はその相補的配列を含む、［１０］に記載の核酸分子。
［１２］前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、［１０］又は［１１］に記載の核酸分子。
［１３］［１０］又は［１１］に記載の核酸分子を含む、ベクター。
［１４］［１２］に記載の核酸分子を含む、ベクター。
［１５］ＢＲＧ１遺伝子配列の一部に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むベクター、及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターを含む、組成物。
［１６］膵癌細胞の増殖又は転移を抑制するためのキットであって、
（ａ）ＢＲＧ１遺伝子のヌクレオチド配列の一部に相補的な配列を含むガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードする核酸、又は該核酸を含むベクター、及び／又は
（ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、又は該ヌクレアーゼをコードする核酸、及び該核酸を含むベクター
を含む、キット。
［１７］前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、［１６］に記載のキット。
［１８］ＢＲＧ１遺伝子発現を阻害することを含む、膵癌細胞の増殖又は転移を抑制する方法。
［１９］ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸、及び／又はＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を膵癌細胞又は膵癌細胞を含む対象に投与することを含み、それによりＢＲＧ１遺伝子発現を阻害することを含む、［１８］に記載の方法。
［２０］前記ＢＲＧ１遺伝子発現を阻害することが、［１］～［９］のいずれかに記載の医薬組成物又は［１３］～［１５］のいずれかに記載のベクターを膵癌細胞又は膵癌細胞を含む対象に投与することによってもたらされる、［１９］に記載の方法。
［２１］治療を必要とする対象においてＢＲＧ１遺伝子発現を阻害することを含む、膵癌の治療方法。
［２２］ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸、及び／又はＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を前記対象に投与することを含み、それによりＢＲＧ１遺伝子発現を阻害することを含む、［２１］に記載の方法。
［２３］前記ＢＲＧ１遺伝子発現を阻害することが、［１］～［９］のいずれかに記載の医薬組成物又は［１３］～［１５］のいずれかに記載のベクターを前記対象に投与することによってもたらされる、［２２］に記載の方法。
［２４］膵癌細胞の増殖又は転移を抑制するための、ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸、及び／又はＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸の使用。
［２５］膵癌の治療のための、ＢＲＧ１遺伝子を標的とする核酸、及び／又はＢＲＧ１遺伝子を標的とする配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＢＲＧ１遺伝子を標的としてその発現を阻害することにより、膵癌細胞の増殖及び転移を抑制する医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、形成された膵癌を治療することができ、また、膵臓から転移した癌を治療することができる。特に、本発明の一態様として、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを利用してＢＲＧ１遺伝子のゲノム配列又はｍＲＮＡ配列を標的とすることができ、当該ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのための、オフターゲット効果を生じないＢＲＧ１遺伝子配列中の標的配列が提供される。該標的配列又はその相補配列を含むガイドＲＮＡ（以下、ｇＲＮＡともいう）およびＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを用いることにより、他の遺伝子に影響を及ぼすことなく、ＢＲＧ１遺伝子を特異的に標的化してその発現を阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
タモキシフェン投与によりＢＲＧ１ノックアウトを誘導するモデルマウスを作製するための遺伝的方法を示す。
Ｂｒｇ１ノックアウトマウスにタモキシフェンを投与した１週間後のＢｒｇ１陽性膵癌細胞のパーセンテージを示す。図中、「ＰＤＡＣｃｅｌｌｓ」は膵癌細胞を示す。
タモキシフェン投与前後の膵癌腫瘍の代表的な超音波エコー画像を示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
タモキシフェンを１週間投与後のＢＫＰＦ（コントロール）マウス（ｎ＝１０）およびＢＫＰＦＣ（Ｂｒｇ１ＫＯ）マウス（ｎ＝６）において超音波スキャンによって分析された膵癌体積変化率を示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
コントロールマウス（全ての膵癌細胞がＢｒｇ１陽性である）（ｎ＝５）におけるＫｉ６７陽性膵癌細胞の割合（％）、およびＢｒｇ１ＫＯマウス（ｎ＝６）中のＢｒｇ１陰性膵癌細胞におけるＫｉ６７陽性膵癌細胞の割合（％）を示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
コントロール（ｎ＝５）およびＢｒｇ１ＫＯマウス（ｎ＝６）におけるＣＣ３陽性細胞の数を示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）投与による、ｍＲＮＡレベルでのＢｒｇ１ノックダウンの効果を示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
４－ＯＨＴ投与による、タンパク質レベルでのＢｒｇ１ノックダウンの効果を示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
コロニー形成アッセイの代表的な画像を示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
コントロール群およびＢｒｇ１ＫＯ群の膵癌細胞の細胞生存の経時的定量（ＭＴＳアッセイ）結果を示す。横軸はプレートに播種後の日数を示す。１、２、３日目に４－ＯＨＴを投与した。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
Ｂｒｇ１ＫＯ群の膵癌細胞における細胞サイクル分析の代表的な画像を示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
Ｂｒｇ１ＫＯ群の膵癌細胞ＥｄＵ－陽性のＳ期膵癌細胞の割合を示す（ｎ＝３）。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
アネキシンＶ陽性の膵癌細胞の割合を示す（ｎ＝３）。図中、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
移植後の日数における皮下腫瘍の体積を示す。
移植後２５日目の皮下腫瘍を示す。
コントロール群（ｎ＝６）およびＢｒｇ１ＫＯ群（ｎ＝１０）の皮下腫瘍におけるＫｉ６７陽性膵癌細胞の数を示す。
コントロール群（ｎ＝６）およびＢｒｇ１ＫＯ群（ｎ＝１０）の皮下腫瘍におけるＣＣ３陽性膵癌細胞の数を示す。
脾注後１４日目の代表的な画像を示す。
コントロール群（ｎ＝３）およびＢｒｇ１ＫＯ群（ｎ＝５）における脾注後１４日目の体重に対する肝臓重量の割合を示す。
コントロール群（ｎ＝３）およびＢｒｇ１ＫＯ群（ｎ＝５）において５つの独立した切片を一緒に合わせることによって決定したＣＫ１９陽性領域の割合を示す。
Ｂｒｇ１ＫＯ群（ｎ＝１０）の肝臓における各転移病変におけるＢｒｇ１陽性膵臓癌細胞の割合を示す。
脾内注射後の肝臓における膵癌細胞の代表的な生物発光画像を示す。
コントロール群（ｎ＝５）およびＢｒｇ１ＫＯ群（ｎ＝４）における脾内注射後の各時点における肝臓転移の生物発光プロットを示す。
ＣＫ１９陽性転移膵癌細胞に対するＣＣ３陽性細胞の割合を示す。
コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｔｒｌ）またはＢＲＧ１を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＲＧ１）で処理した各ヒト膵癌細胞系統における、ＢＲＧ１に対するイムノブロッティングの結果を示す。図中、「Ｃ」および「Ｂ」はそれぞれ、ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＢＲＧ１を示す。
ヒト膵癌細胞系統Ｐａｎｃ－１、Ｃａｐａｎ－２、ＫＰ４における、高感度化学発光基質を用いたＢＲＧ１イムノブロッティングの結果を示す。
ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｔｒｌまたはｓｉＢＲＧ１）で処理された、１日目、３日目および５日目のヒト膵癌細胞系統の生存を示す。ＭＩＡＰａＣａ－２：ｎ＝３、ＢｘＰＣ３およびＣＦＰＡＣ－１：ｎ＝５、その他の細胞系統：ｎ＝４。
ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｔｒｌまたはｓｉＢＲＧ１）で処理されたヒト膵癌細胞系統マトリゲルスフェア形成アッセイの結果を示す。
図４－３に示されるｓｉＲＮＡ処理後５日目の、ｓｉＣｔｒｌ処理ヒト膵癌細胞と比較した、ｓｉＢＲＧ１処理ヒト膵癌細胞の相対的生存率を示す。
図４－４で示されるｓｉＣｔｒｌ処理ヒト膵癌細胞と比較した、ｓｉＢＲＧ１処理ヒト膵癌細胞の相対的スフェア形成率を示す。
各ヒト膵癌細胞系統における、図４－５で計算された相対的生存率と、ＢＲＧ１発現との間の相関関係を示す。Ｘ軸は、ＢｘＰＣ３のＢＲＧ１発現量に相対的な各ヒト膵癌細胞系統のＢＲＧ１発現量を表す。
各ヒト膵癌細胞系統における、図４－６で計算された相対的スフェア形成率と、ＢＲＧ１発現との間の相関関係を示す。Ｘ軸は、ＢｘＰＣ３のＢＲＧ１発現量に相対的な各ヒト膵癌細胞系統のＢＲＧ１発現量を表す。
ＢＲＧ１に対する３つの異なるｓｉＲＮＡ（＃１、＃２、＃３）を用いるＰａｎｃ－１およびＣａｐａｎ－２細胞の相対的ＢＲＧ１ｍＲＮＡ発現、細胞生存アッセイおよびマトリゲルスフェア形成アッセイの結果を示す。
スクランブル（ｓｃｒ）ｇＲＮＡを含有するアデノウイルスで処理したヒト膵癌細胞におけるＢＲＧ１ｍＲＮＡの発現量に相対的な、ＢＲＧ１ＫＯｇＲＮＡを含有するアデノウイルスで処理したヒト膵癌細胞中におけるＢＲＧ１ｍＲＮＡの発現量を示す。
ＢＲＧ１ＫＯまたはｓｃｒｇＲＮＡを含有するアデノウイルスで処理したヒト膵癌細胞における細胞生存アッセイおよびマトリゲルスフェア形成アッセイの結果を示す。相対的生存率（Relative viability）は、１日目と比べた３日目または６日目の生存率を意味する。ｎ＝３。
ＭＩＡＰａＣａ－２細胞における標的部位および可能性のあるオフターゲット部位の配列決定結果を示す。図中に示されるバーは、参照配列と相違する塩基（切断箇所）を示す。ｍｍは、標的配列とのミスマッチ数を示す。
ＡｓＰＣ－１細胞における標的部位および可能性のあるオフターゲット部位の配列決定結果を示す。図中に示されるバーは、参照配列と相違する塩基（切断箇所）を示す。ｍｍは、標的配列とのミスマッチ数を示す。
Ｐａｎｃ－１細胞における標的部位および可能性のあるオフターゲット部位の配列決定結果を示す。図中に示されるバーは、参照配列と相違する塩基（切断箇所）を示す。ｍｍは、標的配列とのミスマッチ数を示す。
ＢＲＧ１ＫＯｇＲＮＡまたはコントロールｇＲＮＡを含有するアデノウイルスで処理し、７日間培養したヒト膵癌オルガノイドの顕微鏡写真である。
ＢＲＧ１ＫＯｇＲＮＡまたはコントロールｇＲＮＡを含有するアデノウイルスで処理し、７日間培養したヒト膵癌オルガノイドの成長を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
（【００１１】以降は省略されています）

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