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公開番号2025102850
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-08
出願番号2025051316,2021573809
出願日2025-03-26,2020-06-12
発明の名称半合成生物における複製、転写および翻訳のための試薬ならびに方法
出願人ザスクリプスリサーチインスティテュート
代理人個人,個人
主分類C07H 21/02 20060101AFI20250701BHJP(有機化学)
要約【課題】1つもしくはそれ以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質またはポリペプチドの産生を増加させるための組成物、方法、細胞、操作された微生物およびキットを提供する。
【解決手段】構造:
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の核酸塩基を含む二本鎖オリゴヌクレオチド。[式中、波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログとの結合点を示す]
【選択図】図1A
特許請求の範囲【請求項１】
構造：
TIFF
2025102850000407.tif
32
81
［式中、
それぞれのＸは、独立して、炭素または窒素であり；
Ｒ
２
は、Ｘが炭素である場合に存在し、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノまたはアジド基であり；
Ｙは、硫黄、酸素、セレンまたは第二級アミンであり；
Ｅは、酸素、硫黄またはセレンであり；
波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログとの結合点を示し、該リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、遊離形態であるか、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α－チオトリホスフェート、β－チオトリホスフェートまたはγ－チオトリホスフェート基に接続されるか、あるいはＲＮＡもしくはＤＮＡ中、またはＲＮＡアナログもしくはＤＮＡアナログ中に含まれる］
の核酸塩基。
続きを表示（約 890 文字）【請求項２】
Ｘは、炭素である、請求項１に記載の核酸塩基。
【請求項３】
Ｅは、硫黄である、請求項１または２に記載の核酸塩基。
【請求項４】
Ｙは、硫黄である、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸塩基。
【請求項５】
構造
TIFF
2025102850000408.tif
29
75
を有する、請求項１に記載の核酸塩基。
【請求項６】
相補的な塩基対形成核酸塩基に結合して、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸塩基。
【請求項７】
相補的な塩基対形成核酸塩基は、
TIFF
2025102850000409.tif
64
162
から選択される、請求項６に記載の核酸塩基。
【請求項８】
二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖であって、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸塩基を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖。
【請求項９】
第１のオリゴヌクレオチド鎖は、
TIFF
2025102850000410.tif
28
107
を含み、第２の鎖は、
TIFF
2025102850000411.tif
64
165
から選択される相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む、請求項８に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖。
【請求項１０】
第２の鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基
TIFF
2025102850000412.tif
30
91
を含む、請求項９に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１９年６月１４日に出願された米国仮出願第６２／８６１，９０１号に対する優先権を主張し、その開示は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
続きを表示（約 2,800 文字）【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年６月１０日に作成され、３６２７１－８０８＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１８，１６２バイトのサイズである。
【０００３】
連邦政府が後援する研究に関する陳述
本明細書に開示される発明は、少なくとも一部分において、国立衛生研究所（ＮＩＨ）による助成金番号５Ｒ３５ＧＭ１１８１７８およびＧＭ１２８３７６およびＦ３１ＧＭ１２８３７６、ならびに全米科学財団（ＮＳＦ）による助成金番号ＮＳＦ／ＤＧＥ－１３４６８３７の米国政府の支援により行われた。したがって、米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
生物学的多様性は、生命が異なる環境に適合するのを可能にし、時間とともに、新たな形態および機能を進化させる。この多様性の起源は、２０の天然アミノ酸によって提供されるタンパク質配列内のバリエーションであり、バリエーションは、４つの天然ＤＮＡヌクレオチドによる生物のゲノムにおいてコードされる。天然アミノ酸よって提供される機能的多様性は高いが、配列空間の広大さは、実際に探索される可能性がある対象を著しく限定し、また、一部の機能は、そもそも利用可能ですらない。ヒドリドの移動、酸化還元活性および求電子結合形成などのための補助因子を自然が使用していることは、これらの限定を証明している。さらにまた、治療薬としてのタンパク質の開発に対する注目の増加により、天然アミノ酸の物理化学的多様性が、化学者によって設計された低分子薬物のものと比較して、著しく制限されるので、これらの限定は問題がある。原理上は、所望の物理化学的性質を有する追加の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡまたは「非天然アミノ酸」）を含むように遺伝コードを拡大することによってこれらの限定を回避することは可能であるはずである。
【０００５】
２０年近く前、大腸菌のｎｃＡＡをコードするアンバー終止コドン（ＵＡＧ）を使用して遺伝コードを拡大することによって、生命体が利用可能な多様性を増加させるための方法が作り出された。これは、メタノコッカス・ヤナシイ由来のｔＲＮＡ－アミノ酸ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）の対を使用して達成され、ここで、ｔＲＮＡは、終止コドンを抑制するために再コードされ、ａａＲＳは、ｔＲＮＡをｎｃＡＡでチャージするように進化した。コドン抑制のこの方法は、その後、他の終止コドン、およびさらに四つ組コドンに拡張されただけでなく、いくつかの他の直交ｔＲＮＡ－ａａＲＳの対（最も顕著には、メタノサルシナ・バルケリ／マゼイ由来のＰｙｌｔＲＮＡシンテターゼの対）の使用にも拡張され、タンパク質に組み込まれるｎｃＡＡの範囲が広がった。これらの方法は、すでに、化学生物学およびタンパク質治療薬の両方に大改革をもたらし始めている。
【０００６】
これらの方法は、原核細胞および真核細胞の両方において最大で２つまでの異なるｎｃＡＡの組み込みを可能にするが、異種再コードｔＲＮＡは、内因性放出因子（ＲＦ）と、
または四つ組コドンの場合では、正常な解読と競合してしまい、ｎｃＡＡの組み込みの効率および忠実度を限定する。アンバー終止コドンを認識し、翻訳を終結させるＲＦ１との競合を排除するために、宿主ゲノム中に出現するアンバー終止コドンの多くもしくはすべての除去、またはＲＦ１の欠失を可能にするためのＲＦ２の改変に努力が向けられてきた。しかしながら、真核生物は、放出因子を１つのみ有し、これは改変することはできるが欠失させることはできず、原核生物では、ＲＦ１の欠失は、他のｔＲＮＡによるアンバー終止コドンのより高い誤った抑制をもたらし、ｎｃＡＡの組み込みの忠実度を低減する。ｎｃＡＡへの再割当のために天然コドンを解放するためにさらにコドン冗長性を利用するための努力は、例えば、翻訳の速度およびタンパク質フォールディングに対するそれらの効果に起因して、コドンが真に冗長ではないので、多面的な効果によって複雑化する場合がある。加えて、コドン再充当は、特に真核生物では、大スケールのゲノム操作の課題によって限定される。
【０００７】
天然コドン再割当に対する代替アプローチは、任意の天然の機能または制約がない完全に新たなコドンの作出であり、リボソームにおけるその認識は、本質的により直交性である。これは、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する第５および第６のヌクレオチドを持つ生物の作出により達成することができる。そのような半合成生物（ＳＳＯ）は、ＵＢＰを含有するＤＮＡを忠実に複製し、それを、非天然ヌクレオチドを含有するｍＲＮＡおよびｔＲＮＡに効率的に転写し、次いで、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の非天然アンチコドンで非天然コドンを効率的に解読することが必要であろう。そのようなＳＳＯは、ｎｃＡＡをコードする実質的に無制限の数の新たなコドンを有するだろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある特定の実施形態において、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の増加した産生のための、方法、細胞、操作された微生物、プラスミドおよびキットを本明細書に記載する。
【０００９】
以下の実施形態が包含される。
【００１０】
実施形態Ａ１は、構造：
TIFF
2025102850000002.tif
32
73
［式中、
それぞれのＸは、独立して、炭素または窒素であり；
Ｒ
２
は、Ｘが炭素である場合に存在し、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノまたはアジド基であり；
Ｙは、硫黄、酸素、セレンまたは第二級アミンであり；
Ｅは、酸素、硫黄またはセレンであり；
波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、遊離形態であるか、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α－チオトリホスフェート、β－チオトリホスフェートまたはγ－チオトリホスフェート基に接続されるか、あるいはＲＮＡもしくはＤＮＡ中、またはＲＮ
ＡアナログもしくはＤＮＡアナログ中に含まれる］
の核酸塩基である。
（【００１１】以降は省略されています）

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