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公開番号2025084803
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-03
出願番号2025023769,2021558847
出願日2025-02-17,2020-04-09
発明の名称標的化されたIn vivoエピジェネティック抑制を介した持続性鎮痛剤
出願人ザリージェンツオブザユニバーシティオブカリフォルニア,The Regents of the University of California
代理人弁理士法人謝国際特許商標事務所
主分類C07K 19/00 20060101AFI20250527BHJP(有機化学)
要約【課題】被験者における慢性疼痛の治療またはコントロールに使用するための、エピジェネティックに基づいたアプローチ及び方法を提供する。
【解決手段】抑制因子ドメインに融合された亜鉛フィンガー(ZF)及び/または抑制因子ドメインに融合されたdCas9を含む構築物を用いて、疼痛を有する被験者を治療するための方法を提供する。このエピジェネティックなアプローチは、永久的な疼痛非感受性が望まれないので、慢性疼痛のフレームワークに有利な一過性の遺伝子治療を可能にする。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
転写抑制因子に結合された操作された亜鉛フィンガーDNA結合ドメインを含む亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物であって、ここで、該亜鉛－フィンガーDNA結合ドメインが、１～６個の亜鉛－フィンガー配列を含み、該亜鉛－フィンガー配列が、
(a) SCN9Aまたは
(b) SCN10Aあるいは
(c)TRPV1/2/3/4、P2XR3、TRPM8、TRPA1、P23X2、P2RY、BDKRB1/2、Hlr3A、ACCNs、TRPV4、TRPC/P、ACCN1/2、SCN1/3/8A/9A、SCN10A、SCN11A、KCNQ、BDNF、OPRD1/K1/M1、CNR1、GABRs、TNF、PLA2、IL1/6/12/18、COX-2、NTRK1、NGF、GDNF、TNF、LIF、CCL1、CNR2、TLR2/4、P2RX47、CCL2、CX3CR1、BDNF、NR1/2、GR1A1-4、GRC1-5、NK1R、CACNA1A-S、及びCACNA2D1からなる群から選択された遺伝子産物をコードする遺伝子において標的核酸配列に結合し、該遺伝子産物の発現が阻害される、亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
前記亜鉛－フィンガー抑制因子は、核局在化シグナルＮＬＳ）、リンカー、またはその両方を含む、請求項１に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物。
【請求項３】
前記転写抑制因子が、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
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, KRAB）からなる群から選択される、請求項１に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物。
【請求項４】
転写抑制因子ドメインは、KRABドメインである、請求項１に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物。
【請求項５】
請求項１に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物の１つまたは複数の成分をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクターであって、好ましくは、前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結される、ベクター。
【請求項７】
前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CAGプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV）LTRプロモーター/転写促進因子、SV40プロモーター、EF1-αプロモーター、CMV即時/初期遺伝子転写促進因子/CBAプロモーター、Nav1.7プロモーター、Nav1.8プロモーター、Nav1.9プロモーター、TRPV1プロモーター、シナプシンプロモーター、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIプロモーター、チューブリンαIプロモーター、神経特異性エノラーゼプロモーター、及びグリア原線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーターからなる群から選択される、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターであって、前記ベクターは、さらに調節制御配列を含み、好ましくは、調節制御配列は、ウッドチャック型肝炎ウイルス転写後調節要素（WPRE）である、ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターであって、前記ベクターは、組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶベクター）であり、好ましくは、前記ｒＡＡＶが、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6 (VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択され、任意選択的に、前記ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の反転反復(ITRs)を含み、または前記ポリヌクレオチドは、ポリA配列を含む、ベクター。
【請求項１０】
請求項6に記載のベクターであって、前記ポリヌクレオチドが、細胞内で発現するように操作されるか、または前記ベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターであるか、あるいは前記ベクターが、配列番号:7のKRAB配列をコードする核酸を含む、ベクター。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【関連出願への相互参照】
【０００１】
本出願は、35 U.S.C.§119条に基づいて、2019年4月9日に出願された仮出願シリアル番号62/831,706及び2019年7月23日に出願された仮出願シリアル番号62/877,810の優先権を主張する。あらゆる目的のため、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 4,300 文字）【政府援助研究に関する陳述】
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所に授与されたCA222826、GM123313、及びHG009285に基づく政府援助により行われたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本開示は、抑制因子ドメインと融合した亜鉛フィンガー及び/または抑制因子ドメインと融合したdCas9を含むゲノム編集構築物を用いて、治療を必要とする被験者における疼痛を治療及びコントロールする、エピジェネティックに基づいたアプローチ及び方法を提供する。
【配列リストの参照による組み込み】
【０００４】
“Sequence-Listing_ST25.txt”と題する配列リスト（2020年4月9日に作成、121,918バイト、IBM-PC、MS-Windows OS上で機械フォーマットされた）が、本出願に付随されている。あらゆる目的のため、該配列リスト全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００５】
世界人口の19%～50%が慢性疼痛の影響を受け、米国のみで1億人以上がそれに罹患している。また、高齢化や慢性疾患のため、慢性疼痛を訴える人々の数は、2035年までに増加傾向と予想される。慢性疼痛は、癌、糖尿病、及び心臓血管疾患よりも一般的であるが、その治療薬の開発は、他の治療領域で見られる程顕著に進んでいない。さらに、現在の慢性疼痛の標準治療は、しばしば、麻薬様物質に依存する。これらは、副作用及び顕著な中毒の危険性を有する可能性がある。数十年にわたる研究もかかわらず、広範に有効で持続的かつ非依存性の慢性疼痛の治療法はまだ達成されていない。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、転写抑制因子に融合され、少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)に関連付けられ、核酸分解酵素が不活性化されたCas9(dCas9)タンパク質を含む組換え遺伝子抑制因子複合体を提供し、ここで、該gRNAが、TRPV1/2/3/4、P2XR3、TRPM8、TRPA1、P23X2、P2RY、BDKRB1/2、Hlr3A、ACCNs、TRPV4、TRPC/P、ACCN1/2、SCN1/3/8A/9A、SCN10A、SCN11A、KCNQ、BDNF、OPRD1/K1/M1、CNR1、GABRs、TNF、PLA2、IL1/6/12/18、COX-2、NTRK1、NGF、 GDNF、TNF、LIF、CCL1、CNR2、TLR2/4、P2RX47、CCL2、CX3CR1、BDNF、NR1/2、GR1A1-4、 GRC1-5、NK1R、CACNA1A-S、及びCACNA2D1からなる群から選択された遺伝子産物をコードする標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子産物の発現が阻害される。一実施形態では、前記標的核酸配列は、染色体2の2q24.3の位置にある。別のまたはさらなる実施形態では、前記gRNAは、11～107のいずれかに示される配列によってコードされる配列を含む。別のまたはさらなる実施形態では、前記gRNAは、SCN9A産物(Nav1.7)をコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズする。別のまたはさらなる実施形態では、前記転写抑制因子は、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
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, KRAB）からなる群から選択される。別の実施形態では、前記転写抑制因子ドメインは、KRABドメインである。
【０００７】
本開示はまた、上記及び本明細書に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体の1つまたは複数の成分をコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現に最適化されたコドンである。
【０００８】
本開示はまた、1つまたは複数の成分をコードし、本開示の組換え遺伝子抑制因子複合体を生成する本開示のポリヌクレオチドを含むベクターまたはベクター系を提供する。一実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結される。別の実施形態では、前記プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CAGプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV）LTRプロモーター/転写促進因子、SV40プロモーター、EF1-αプロモーター、CMV即時/初期遺伝子転写促進因子/CBAプロモーター、Nav1.7プロモーター、Nav1.8プロモーター、Nav1.9プロモーター、TRPV1プロモーター、シナプシンプロモーター、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIプロモーター、チューブリンαIプロモーター、神経特異性エノラーゼプロモーター、及びグリア原線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーターからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、前記ベクターは、少なくとも1つのガイドRNAコード配列の上流にpolIIIプロモーターを含む。さらなる実施形態では、前記polIIIプロモーターは、U6及びH1プロモーターから選択される。別の実施形態では、前記ベクターは、調節制御配列をさらに含む。さらなる実施形態では、前記調節制御配列は、ウッドチャック型肝炎ウイルス後転写調節因子(WPRE)である。別の実施形態では、前記ベクターは、組換えアデノ関連ウイルスベクター(rAAVベクター)である。別の実施形態では、前記rAAVは、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、 AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択される。さらに別のまたはさらなる実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の反転反復(ITR)を含む。さらに別のまたはさらなる実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ポリA配列を含む。別の実施形態では、前記ベクター及びポリヌクレオチドは、細胞内で発現されるように操作される。さらに別の実施形態では、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである。さらに別の実施形態では、前記ベクターは、分割dCas9ベクター系を含む。別の実施形態では、前記ベクターは、配列番号:2に示されるような配列またはそれと少なくとも90%同一の配列を有するdCas9をコードする核酸を含み、gRNAと複合することができ、かつ核酸分解酵素の活性を欠いている。さらに別の実施形態では、前記ベクターは、配列番号:7のKRAB配列またはそれと少なくとも90%同一の配列をコードする核酸を含み、かつ転写を抑制することができる。さらに別の実施形態では、前記分割ベクター系は、配列番号:3、4、及び10から選択されるベクター配列、またはそれらと少なくとも90%～99%同一の配列を含む。
【０００９】
本開示は、転写抑制因子に結合された、操作された亜鉛フィンガーDNA結合ドメインを含む亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物を提供し、ここで、該亜鉛フィンガーDNA結合ドメインが、1～6個の亜鉛-フィンガー配列を含み、該亜鉛フィンガー配列が、TRPV1/2/3/4、P2XR3、TRPM8、TRPA1、P23X2、P2RY、BDKRB1/2、Hlr3A、ACCNs、TRPV4、TRPC/P、ACCN1/2、SCN1/3/8A/9A、SCN10A、SCN11A、KCNQ、BDNF、OPRD1/K1/M1、CNR1、GABRs、TNF、PLA2、IL1/6/12/18、COX-2、NTRK1、NGF、GDNF、TNF、LIF、CCL1、CNR2、TLR2/4、P2RX47、CCL2、CX3CR1、BDNF、NR1/2、GR1A1-4、GRC1-5、NK1R、CACNA1A-S、及びCACNA2D1からなる群から選択された遺伝子産物をコードする遺伝子において、標的核酸配列に結合し、該遺伝子産物の発現が阻害される。一実施形態では、前記標的核酸配列は、表2に示されている配列である。さらに別の実施形態では、前記転写抑制因子は、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
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12
79
, KRAB）からなる群から選択される。
【００１０】
本開示はまた、上記及び本明細書に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物をコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現に最適化されたコドンである。
（【００１１】以降は省略されています）

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