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公開番号2025076692
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-16
出願番号2023188455
出願日2023-11-02
発明の名称ヒストンH3-H4オクタソームの試験管内再構築法
出願人国立大学法人北海道大学
代理人個人,個人
主分類C07K 2/00 20060101AFI20250509BHJP(有機化学)
要約【課題】生理的条件下で、イン・ビトロでH3-H4オクタソームを再構築する方法を開発すること。
【解決手段】H3-H4オクタソームの再構築方法であって、(a)小麦胚芽無細胞抽出液、ヒストンH3およびH4をそれぞれコードするmRNA、および鋳型DNAを含む混合物をインキュベートすること、または(b)小麦胚芽無細胞抽出液およびヒストンH3およびH4をそれぞれコードするmRNAを含む混合物をインキュベートした後に、鋳型DNAと共にインキュベートすること、を含む方法等が提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｈ３－Ｈ４オクタソームの再構築方法であって、
（ａ）小麦胚芽無細胞抽出液、ヒストンＨ３およびＨ４をそれぞれコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物をインキュベートすること、または
（ｂ）小麦胚芽無細胞抽出液およびヒストンＨ３およびＨ４をそれぞれコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートした後に、鋳型ＤＮＡと共にインキュベートすること
を含む、方法。
続きを表示（約 540 文字）【請求項２】
ヒストンが動物または植物由来である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
動物がヒトである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
Ｈ３が変種ヒストンである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記混合物がさらにクロマチン再構成因子をコードするｍＲＮＡを含むか、または前記混合物をクロマチン再構成因子と共にさらにインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
小麦胚芽無細胞抽出液中で発現されたヒストンＨ３およびＨ４と、鋳型ＤＮＡとからなる、再構築されたＨ３－Ｈ４オクタソーム。
【請求項７】
ヒストンが動物または植物由来である、請求項６記載の再構築されたＨ３－Ｈ４オクタソーム。
【請求項８】
動物がヒトである、請求項７記載の再構築されたＨ３－Ｈ４オクタソーム。
【請求項９】
Ｈ３が変種ヒストンである、請求項６～８のいずれか１項記載の再構築されたＨ３－Ｈ４オクタソーム。
【請求項１０】
請求項１または５記載の方法によって再構築された、Ｈ３－Ｈ４オクタソーム。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験管内でヒストンＨ３－Ｈ４オクタソームの再構築を行う方法、および該方法によって構築された機能的ヒストンＨ３－Ｈ４オクタソームに関する。
続きを表示（約 4,000 文字）【背景技術】
【０００２】
真核生物の全てのゲノム情報（ＤＮＡ）は、クロマチンと呼ばれる染色体構造により高次に折り畳まれ、細胞核内に収納されている。クロマチンは、基本構造であるヌクレオソームの繰り返し単位から構成されており、ヌクレオソームは、４種のヒストンタンパク質（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４）から成る八量体コアタンパク質と、その周囲に巻き付いた約１５０ｂｐの二本鎖ＤＮＡとから構成される。染色体の時間空間的な構造変化は、細胞周期に伴うＤＮＡの複製や修復、転写を可能としていると考えられ、これらの制御を担っている要素が、ＤＮＡのメチル化や、ヒストンタンパク質の様々な化学修飾である。さらに、４種の正規ヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４）にそれぞれ相同な機能を持つ変種ヒストンの存在も知られており、染色体の構造変化に寄与している。
【０００３】
ヌクレオソームは、細胞のクロマチンにおける代表的なヒストン－ＤＮＡ複合体であるが、別のヒストン－ＤＮＡ複合体の存在も知られていた。なかでも、Ｈ３－Ｈ４オクタソームは、ヌクレオソームに匹敵するサイズを有するヌクレオソーム様粒子であり、ヌクレオソームとは異なり、Ｈ３とＨ４の２種のヒストンのみから構成される八量体コアタンパク質を有する。近年、モデル酵母において、Ｈ３－Ｈ４オクタソームの存在が示唆された（非特許文献１）。非特許文献１では、Ｈ３－Ｈ４オクタソームを従来の塩透析法により再構築し、Ｈ３－Ｈ４オクタソームが、４コピーのＨ３－Ｈ４二量体から構成される八量体コアタンパク質の周囲に１２０～１３０ｂｐの二本鎖ＤＮＡが巻き付いている立体構造を有する事を明らかにした。
【０００４】
塩透析法は、試験管内においてクロマチンを再構築する方法としてよく知られており、二本鎖ＤＮＡと大腸菌異種発現したヒストン（組換えヒストン）の混合物を塩透析することによってタンパク質複合体をリフォールディングさせる。しかしながら、塩透析法では、１）大腸菌異種発現したヒストンは構造が壊れ不溶化するため、非生理的条件下で可溶化する必要があること、２）塩濃度依存的に（すなわち、非生理的条件下で）再構築するため、天然に近い状態で再構成されたクロマチンやオクタソームを提供できないこと、などの問題がある。また、最近、発明者らのグループは、小麦胚芽無細胞抽出液を用いて、ヒトおよびショウジョウバエ由来の可溶化ヒストンとクロマチン再構成因子の共発現反応によりクロマチン再構築を行う技術を開発した（非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、小麦胚芽無細胞抽出液を用いてＨ３－Ｈ４オクタソームを再構築できるかは不明であり、今までに小麦胚芽無細胞抽出液を利用した発現系をＨ３－Ｈ４オクタソームの再構築に応用した例は無い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Ｎｏｚａｗａら、ＰＮＡＳ，２０２２，Ｖｏｌ．１１９，Ｎｏ．４５，ｅ２２０６５４２１１９
Ｏｋｉｍｕｎｅら、ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６２（２０２０）
Ｅｎｄｏら、ＦＥＢＳＯｐｅｎＢｉｏ，１１（２０２１），１５５２－１５６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
今後、Ｈ３－Ｈ４オクタソームの真核生物核内における分子機構の解明が、生命現象の根幹に位置するゲノム構造および機能の理解に必須と考えられるが、そのためには、天然に近い状態での評価するための染色体構造が必要となる。このような情況下、本発明は、生理的条件下で、イン・ビトロでＨ３－Ｈ４オクタソームを再構築する方法を開発することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは鋭意研究の結果、驚くべきことに、小麦胚芽無細胞系において、動物または植物のヒストンタンパク質Ｈ３およびＨ４をそれぞれコードしたｍＲＮＡを鋳型ＤＮＡの存在下で共発現することにより、生理的条件下で機能的Ｈ３－Ｈ４オクタソームを再構築することに成功した。さらに、変種ヒストンを含む機能的Ｈ３－Ｈ４オクタソームの再構築にも成功した。さらに、クロマチン再構成因子をコードするｍＲＮＡを加えて共発現させることにより、Ｈ３－Ｈ４オクタソームの再構築が促進されることも見出した。かくして、本発明を完成させた。
【０００８】
したがって、本発明は以下の態様を提供する。
［１］Ｈ３－Ｈ４オクタソームの再構築方法であって、
（ａ）小麦胚芽無細胞抽出液、ヒストンＨ３およびＨ４をそれぞれコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物をインキュベートすること、または
（ｂ）小麦胚芽無細胞抽出液およびヒストンＨ３およびＨ４をそれぞれコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートした後に、鋳型ＤＮＡと共にインキュベートすること
を含む、方法。
［２］ヒストンが動物または植物由来である、［１］記載の方法。
［３］動物がヒトである、［２］記載の方法。
［４］Ｈ３が変種ヒストンである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記混合物がさらにクロマチン再構成因子をコードするｍＲＮＡを含むか、または前記混合物をクロマチン再構成因子と共にさらにインキュベートすることを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］小麦胚芽無細胞抽出液中で発現されたヒストンＨ３およびＨ４と、鋳型ＤＮＡとからなる、再構築されたＨ３－Ｈ４オクタソーム。
［７］ヒストンが動物または植物由来である、［６］記載の再構築されたＨ３－Ｈ４オクタソーム。
［８］動物がヒトである、［７］記載の方法。
［９］Ｈ３が変種ヒストンである、［６］または［７］記載の再構築されたＨ３－Ｈ４オクタソーム。
［１０］［１］または［５］記載の方法によって再構築された、Ｈ３－Ｈ４オクタソーム。
［１１］Ｈ３－Ｈ４オクタソームの構築を促進または阻害する物質をスクリーニングするための方法であって、
（１）
（ａ）小麦胚芽無細胞抽出液、ヒストンＨ３およびＨ４をそれぞれコードするｍＲＮＡ、および鋳型ＤＮＡを含む混合物を候補物質の存在下でインキュベートすること、
（ｂ）小麦胚芽無細胞抽出液およびヒストンＨ３およびＨ４をそれぞれコードするｍＲＮＡを含む混合物を候補物質の存在下でインキュベートした後に、鋳型ＤＮＡと共にインキュベートすること、または
（ｃ）小麦胚芽無細胞抽出液およびヒストンＨ３およびＨ４をそれぞれコードするｍＲＮＡを含む混合物をインキュベートした後に、鋳型ＤＮＡと共に候補物質の存在下でインキュベートすること、および
（２）Ｈ３－Ｈ４オクタソームが再構築されたか否かを評価すること
を含む、方法。
［１２］前記（ａ）または（ｂ）において、前記候補物質が小麦胚芽無細胞抽出液中で共発現されている、［１１］記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、生理的条件下において、Ｈ３－Ｈ４オクタソームを試験管内で簡便に再構築することができる。さらに、本発明のＨ３－Ｈ４オクタソーム再構築過程は、Ｈ３－Ｈ４オクタソーム再構築機能を促進あるいは阻害する新規因子をスクリーニングする方法に利用できる。本発明によれば、生理的条件下で再構成されたＨ３－Ｈ４オクタソームが提供されるので、本発明は、エピジェネティクスの研究を行う上で重要な評価系を提供し、また、創薬スクリーニング等に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１は、小麦胚芽無細胞抽出液において、クロマチン再構成因子を用いずに又は用いて、再構築されたヒトＨ３－Ｈ４オクタソームについて、スーパーコイリングアッセイの結果を示す。図中、ＲＣは「リラックス型ＤＮＡ」を示し、ＳＣは「スーパーコイル化ＤＮＡ」を示す。クロマチン再構成因子Ｎａｐ１Ｌ１を使用しなかった結果を「－」、使用した結果を「＋」のレーンに示す。
図２は、小麦胚芽無細胞抽出液中におけるヒトＨ３．Ｘ－Ｈ４オクタソームの再構築のための、ヒトクロマチン再構成因子Ｎａｐ１Ｌ１の最適な添加量を決定するための実験結果を示す。
図３は、小麦胚芽無細胞抽出液において、クロマチン再構成因子を用いずに又は用いて、再構築されたヒトＨ３－Ｈ４オクタソームについて、スーパーコイリングアッセイの結果を示す。図中、ＲＣは「リラックス型ＤＮＡ」を示し、ＳＣは「スーパーコイル化ＤＮＡ」を示す。クロマチン再構成因子ＡｔＮＡＰ１；３を使用しなかった結果を「－」、使用した結果を「＋」のレーンに示す。
図４は、小麦胚芽無細胞抽出液による植物Ｈ３－Ｈ４オクタソーム再構築について、スーパーコイリングアッセイの結果を示す。図中、ＲＣは「リラックス型ＤＮＡ」を示し、ＳＣは「スーパーコイル化ＤＮＡ」を示す。
図５は、小麦胚芽無細胞抽出液による植物Ｈ３－Ｈ４オクタソーム再構築について、ＭＮａｓｅアッセイの結果を示す。
図６は、小麦胚芽無細胞抽出液において、クロマチン再構成因子を用いた植物Ｈ３－Ｈ４オクタソームの再構築について、スーパーコイリングアッセイの結果を示す。図中、ＲＣは「リラックス型ＤＮＡ」を示し、ＳＣは「スーパーコイル化ＤＮＡ」を示す。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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