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公開番号2025023186
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-14
出願番号2024209643,2023013542
出願日2024-12-02,2019-02-27
発明の名称微生物分析用試料の調製方法、微生物の分析方法、微生物の識別方法および微生物分析用キット
出願人株式会社島津製作所,学校法人名城大学
代理人弁理士法人京都国際特許事務所
主分類G01N 27/62 20210101AFI20250206BHJP(測定;試験)
要約【課題】質量分析により、微生物に含まれる分子をより再現性よく安定検出する。
【解決手段】微生物分析用試料の調製方法は、微生物の濃度が、1×10⁶CFU/μL以上6×10⁷CFU/μL以下の試料溶液を調製することと、試料溶液の遠心分離を行うことと、遠心分離により得られた上清を用いて、質量分析用試料を調製することとを備える。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
微生物の濃度が、１×１０
６
ＣＦＵ／μＬ以上６×１０
７
ＣＦＵ／μＬ以下の試料溶液を調製し、
前記試料溶液の遠心分離を行い、
前記遠心分離により得られた上清を用いて、微生物分析用試料を調製し、
マトリックス支援レーザ脱離イオン化により前記微生物分析用試料をイオン化し、第１質量分析を行う、微生物の識別方法であって、
マトリックスを含む溶液に前記微生物を加えた後、前記溶液の濁度を調整すること、前記微生物を含む溶液の濁度を調整した後、濁度が調整された微生物を含む溶液とマトリックスを含む溶液とを混合すること、前記微生物を秤量し、秤量された前記微生物とマトリックスを含む溶液とを混合すること、および、前記微生物を秤量し、秤量された前記微生物を含む溶液を調製した後、調製された前記微生物を含む溶液とマトリックスを含む溶液とを混合すること、のいずれかにより前記試料溶液を調製し、
前記マトリックスの添加剤としてメチレンジホスホン酸およびＮ－デシル－β－Ｄ－マルトピラノシドを用いて前記微生物分析用試料を調製する微生物の識別方法。
続きを表示（約 1,500 文字）【請求項２】
微生物の濃度が、１×１０
６
ＣＦＵ／μＬ以上６×１０
７
ＣＦＵ／μＬ以下の試料溶液を調製し、
前記試料溶液の遠心分離を行い、
前記遠心分離により得られた上清を用いて、微生物分析用試料を調製し、
マトリックス支援レーザ脱離イオン化により前記微生物分析用試料をイオン化し、第１質量分析を行う、微生物の識別方法であって、
前記第１質量分析では、１００００以上のｍ／ｚに対応するピークを検出し、
前記微生物とは異なる微生物から調製された微生物分析用試料の第２質量分析を行い、前記第２質量分析により得られたデータに基づいて前記第１質量分析における検出器の電圧を設定し、
前記微生物とは異なる微生物が大腸菌であり、
前記第２質量分析において、大腸菌のマススペクトルのｍ／ｚ２２０００以上２３０００以下の範囲における最も強度の大きいピーク、および、前記マススペクトルのｍ／ｚ２３０００以上２４０００以下の範囲における最も強度の大きいピークの少なくとも一つの強度に基づいて、前記検出器の電圧を設定する微生物の識別方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の微生物の識別方法において、
前記遠心分離の前に、前記試料溶液に超音波処理を行うことを備える微生物の識別方法。
【請求項４】
請求項２に記載の微生物の識別方法において、
マトリックスを含む溶液に前記微生物を加えた後、前記溶液の濁度を調整すること、前記微生物を含む溶液の濁度を調整した後、濁度が調整された微生物を含む溶液とマトリックスを含む溶液とを混合すること、前記微生物を秤量し、秤量された前記微生物とマトリックスを含む溶液とを混合すること、および、前記微生物を秤量し、秤量された前記微生物を含む溶液を調製した後、調製された前記微生物を含む溶液とマトリックスを含む溶液とを混合すること、のいずれかにより前記試料溶液を調製する微生物の識別方法。
【請求項５】
請求項４に記載の微生物の識別方法において、
前記マトリックスの添加剤としてホスホン酸基を含む化合物および界面活性剤の少なくとも一つを用いて前記微生物分析用試料を調製する微生物の識別方法。
【請求項６】
請求項１、３、４及び５のいずれか一項に記載の微生物の識別方法において、
前記マトリックスは、シナピン酸である微生物の識別方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の微生物の識別方法において、
前記微生物は、サルモネラ属の細菌である微生物の識別方法。
【請求項８】
請求項１、３、６、及び７のいずれか一項に記載の微生物の識別方法において、
前記第１質量分析では、１００００以上のｍ／ｚに対応するピークを検出する微生物の識別方法。
【請求項９】
請求項８に記載の微生物の識別方法において、
前記微生物とは異なる微生物から調製された微生物分析用試料の第２質量分析を行い、前記第２質量分析により得られたデータに基づいて前記第１質量分析における検出器の電圧を設定することを備える微生物の識別方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の微生物の識別方法において、
前記第２質量分析は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化により前記微生物分析用試料をイオン化する微生物の識別方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物分析用試料の調製方法、微生物の分析方法、微生物の識別方法および微生物分析用キットに関する。
続きを表示（約 7,800 文字）【背景技術】
【０００２】
質量分析により、微生物に含まれる分子を解析することが行われている。特に、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）質量分析（ＭＡＬＤＩ質量分析）により微生物の種類の識別を行う場合、ＤＮＡの塩基配列を決定し当該配列に基づいて識別を行う方法よりも迅速に行うことができるため極めて有用である。この場合、得られたマススペクトルにおける予め定められたピークの位置に基づいて、微生物の識別が行われる（特許文献１参照）。微生物の識別の精度を上げるためには、ピークに対応するタンパク質などの分子が微生物に存在しているときに、再現性良く当該分子のイオンをピークとして検出する必要がある。このように、より精密に微生物に含まれる分子を解析するためには、質量分析の精度を上げることが望ましい。質量分析の精度を上げるためには、ピーク検出の感度向上および再現性の向上が望まれる。
【０００３】
サルモネラの血清型あるいは株の識別に有効なマーカータンパク質１２種類と、その解析法が報告されている（非特許文献１）。より再現性の高い安定した解析を行うためには、マーカータンパク質に対応するピークの感度を上げたり、分析条件のばらつきを低下させたりすることが考えられる。
【０００４】
ＭＡＬＤＩ質量分析における感度を上げるために、マトリックスの添加剤として、メチレンジホスホン酸（Methylenediphosphonic acid：ＭＤＰＮＡ）(特許文献２、非特許文献２)、および界面活性剤であるＮ-デシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＭＰ）(非特許文献３、非特許文献４)を用いることが提案されている。
【０００５】
微生物のＭＡＬＤＩ質量分析の分析条件については、再現性または検出限界等の観点から、非特許文献５、非特許文献７および非特許文献９の総説をはじめとする幾つかの文献で報告されている。非特許文献６では、コクシエラ菌（Coxiella burnetti）を異なる複数の濃度で含む試料溶液についてＭＡＬＤＩ質量分析を行ったことが報告されている。非特許文献８では、サルモネラ・エンテリカ（血清型Choleraesuis; Salmonella Choleraesuis）に、免疫磁気分離法と組み合わせたＭＡＬＤＩ質量分析の検出限界が報告されている。非特許文献１０では、所定の濃度の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、セレウス菌（Bacillus cereus）およびエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）の所定の濃度におけるＭＡＬＤＩ質量分析が報告されている。非特許文献１１および非特許文献１２では、免疫磁気分離法および／またはファージ増幅と組み合わせた所定の濃度の大腸菌のＭＡＬＤＩ質量分析が報告されている。非特許文献１３および非特許文献１４では、磁性ナノ粒子を用いた黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、腐性ブドウ球菌（Staphylococcus saprophyticus）または大腸菌のＭＡＬＤＩ質量分析の検出限界が報告されている。
【０００６】
超音波処理を用いたＭＡＬＤＩ質量分析用試料の調製については、非特許文献１５に、大腸菌への適用が報告されている。さらに、グラム陽性菌、およびグラム陰性菌の細胞分解の目的でも使用されている（非特許文献１６）。非特許文献１７には、加水分解酵素リゾチームを用いた分解処理と超音波処理とを組み合わせた例が報告されている。
【０００７】
遠心分離を用いた質量分析用試料の調製については、病原性の菌の不活性化の際、菌体を、トリフルオロ酢酸を含む溶液で処理した後、懸濁液を遠心分離、およびろ過する方法などが、提案されている（非特許文献１８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
特開２０１５－１８４０２０号公報
特開２００９－１２１８５７号公報
【非特許文献】
【０００９】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
微生物の質量分析におけるピーク検出が不安定で、微生物に含まれる分子のピーク検出の再現性が低い場合があった。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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