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公開番号2024169674
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-05
出願番号2024166397,2023150371
出願日2024-09-25,2019-04-19
発明の名称凍結保存用高分子水溶液
出願人イビデン株式会社
代理人弁理士法人朝日奈特許事務所
主分類C12N 1/04 20060101AFI20241128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】細胞生存率の高い生体試料の凍結保存用の高分子水溶液、ならびに、それを用いた氷晶の成長を防止または抑制する方法および生体試料を凍結保存方法を提供することを目的とする。
【解決手段】水性溶媒中に水溶性高分子またはその塩を含み、極限粘度が0.20dL/g以上、0.95dL/g以下であり、DSC測定で吸熱ピークが確認されないか、または吸熱ピークが確認される温度が-1.4℃を超え1.1℃以下であり、高分子水溶液を-80℃で固化した状態の生体試料の正射影面積が降温前と比べて減少している、凍結保存用の高分子水溶液およびそれを用いた生体試料の凍結保存方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
水性溶媒中に水溶性高分子またはその塩を含み、生体試料の凍結保存用に用いられる高分子水溶液であって、
前記高分子水溶液の極限粘度（η）が、０．２０ｄＬ／ｇ以上、０．９５ｄＬ／ｇ以下であり、
示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いた下記（１）～（２）の測定条件によって得られる昇温過程のＤＳＣ曲線において、
ＤＳＣで測定した吸熱ピークが確認されないか、または吸熱ピークが確認される温度が－１．４℃を超え、１．１℃以下であることを特徴とする高分子水溶液。
（ＤＳＣ測定条件）
（１）２０℃で１分間保持後、５℃／ｍｉｎの降温速度で－８０℃まで降温。
（２）－８０℃で１分間保持後、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で２０℃まで昇温。
続きを表示（約 850 文字）【請求項２】
前記（１）～（２）の測定条件によって得られる昇温過程のＤＳＣ曲線において、
ＤＳＣで測定した吸熱ピークが確認されないか、または吸熱ピークが確認される温度が－１．４℃を超え、１．１℃以下であり、前記高分子水溶液を－８０℃で固化した状態における前記生体試料の正射影面積が、降温前の前記生体試料の正射影面積に比べて減少している請求項１記載の高分子溶液。
【請求項３】
前記（１）～（２）の測定条件によって得られる降温過程のＤＳＣ曲線において、前記降温過程における、発熱ピークの発熱量が、０Ｊ／ｇ、または水からなる基準液の対応する発熱量の６５％以下である請求項１または２に記載の高分子水溶液。
【請求項４】
前記高分子溶液のＤＳＣで測定した発熱ピークの発熱量が、０Ｊ／ｇ、または水からなる基準液の対応する発熱量の４０％以下である請求項１～３のいずれか１項に記載の高分子水溶液。
【請求項５】
前記高分子水溶液が、前記水溶性高分子またはその塩を０．１ｗ／ｖ％以上、２０ｗ／ｖ％以下の含有量で含む請求項１～４のいずれか１項に記載の高分子水溶液。
【請求項６】
前記水溶性高分子が、糖残基を含む水溶性高分子である請求項１～５のいずれか１項に記載の高分子水溶液。
【請求項７】
前記生体試料が、細胞、組織、または、膜もしくは凝集体である組織様物である請求項１～６のいずれか１項に記載の高分子水溶液。
【請求項８】
前記生体試料が、間葉系幹細胞、血球細胞、内皮細胞、または移植用組織である請求項７記載の高分子水溶液。
【請求項９】
前記生体試料が、精子、卵子、または受精卵である請求項７記載の高分子水溶液。
【請求項１０】
前記生体試料のガラス化保存に用いられる、請求項１～９のいずれか１項に記載の高分子水溶液。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の凍結保存用の高分子水溶液に関する。また、本発明は、高分子水溶液を用いて生体試料における氷晶の成長を防止または抑制する方法、生体試料の凍結保存方法に関する。
続きを表示（約 2,100 文字）【背景技術】
【０００２】
近年の再生医療研究の飛躍的な発展に伴い、ヒトにのみならず獣医分野においても細胞治療などの再生医療が積極的に行われている。生体から採取した骨髄由来間葉系幹細胞や脂肪由来間葉系幹細胞は、採取の後に大量に増やし、上記のような再生医療や再生医療研究に用いられる。この際、余剰に増やした細胞を凍結保存し、適宜使用することが一般的である。また、このような細胞の安定供給に対する需要も高まっている。
【０００３】
細胞の凍結保存メカニズムにおいて、凍結および／または解凍の過程で細胞内に氷結晶が成長すると、細胞膜や細胞内構造が損傷を受けたり、細胞のタンパク質が変性したりして細胞が致命的なダメージを受けてしまうことが知られている。したがって、細胞を凍結保存する際には、細胞内凍結を防ぐことが重要であり、通常、細胞の凍結保存には、メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、プロピレングリコールなどの低分子化合物が細胞内浸透型の凍結保護試薬として、培養培地などの緩衝液に加えることにより用いられている（特許文献１）。このうち、ＤＭＳＯが最もよく用いられており、細胞や細胞小器官を保護する効果は良好である。しかしながら、細胞内浸透型の凍結保存液では、細胞内に凍結保護試薬である低分子化合物が浸透するため、凍結保護試薬の細胞への影響が懸念されている（非特許文献１）。
【０００４】
そこで、化学物質の代わりに、凍結保護試薬として天然の凍結保護剤を利用する試みも行われている。例えば、二糖、オリゴ糖、または高分子多糖が非浸透型の凍結保護試薬として、培養培地などの緩衝液に加えることが知られている。
【０００５】
また、ハイドロゲルを形成する架橋体内に生体成分を保持させる方法も検討されている。特許文献２には、重量平均分子量が５０００～４００万である原料のヒアルロン酸に、水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する側鎖が導入された修飾ヒアルロン酸を原料とした生体成分用保存剤が記載されている。修飾ヒアルロン酸は、ポリビニルアルコールなどの複数の水酸基を有する化合物の水酸基と反応して修飾ヒアルロン酸を架橋した架橋物となり、この寒天状のハイドロゲル中に生体成分が包埋されることにより保存剤として使用されている。特許文献２に記載のハイドロゲルの実際の保存剤としての分子量は数百万以上であると推測される。特許文献２においては、生体成分の保存は約４℃の冷蔵で実施されており保存期間は数日程度である。
【０００６】
また、特許文献３では、ポリアミノ酸のアミノ基が、カルボン酸無水物でカルボキシル化（またはアセチル化）されることによりブロックされているカルボキシル化ポリアミノ酸と有機両性剤とを含む凍結保存組成物が記載されている。さらに、特許文献４では、フルクタンが細胞保存液の有効成分として開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
特開昭６３－２１６４７６号公報
国際公開第２０１６／０７６３１７号
特表２０１８－５３３３７７号公報
特開２０１２－２３５７２８号公報
【非特許文献】
【０００８】
REJUVENATION RESEARCH Volume 18 Number 5,2015 Mary Ann Liebert, Inc.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
細胞内浸透型の凍結保護物質は、細胞の脱水を促進させることにより、細胞内に形成される氷晶の形成速度を遅らせ、氷晶形成を阻害する。特にＤＭＳＯは細胞内に浸透しやすく、したがって、哺乳動物細胞などの複雑な構造をもつ細胞の凍結保存に有効であるが、上述の非特許文献１にも記載されているように、ＤＭＳＯのような化学物質は細胞毒性を有している。凍結保護物質の細胞内への浸透が進み細胞内濃度が上昇すると毒性の影響も高まると考えられる。
【００１０】
さらに、ＤＭＳＯは、ＨＬ－６０細胞やＰ１９ＣＬ６細胞（マウス胎生期癌（embryonal carcinoma）細胞由来）などの分化を誘導すること（PNAS March 27, 2001 98 (7) 3826-3831.およびBiochem Biophys Res Commun. 2004 Sep 24;322(3):759-65.）、また、ＥＳ細胞の分化に影響を及ぼすことが報告されている（Cryobiology. 2006 Oct;53(2):194-205.）。したがって、凍結保護試薬としてのＤＭＳＯの使用は、幹細胞における未分化性や機能性の維持が必要である場合の細胞保存には適さないことが考えられる。また、ＤＭＳＯを用いて試料を長期保存する場合、取扱い管理が必要となる液体窒素中または雰囲気下での試料の保存が必要不可欠であり、再生医療や再生医療研究の普及への課題となると考えられる。
（【００１１】以降は省略されています）

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