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公開番号2025156592
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-14
出願番号2025134235,2024010099
出願日2025-08-12,2018-06-08
発明の名称DNAが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット
出願人国立大学法人大阪大学
代理人弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
主分類C12N 15/09 20060101AFI20251002BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】真核細胞においてCRISPR-Cas3システムを確立すること。
【解決手段】 DNAが編集された真核細胞を製造する方法であって、真核細胞にCRISPR-Cas3システムを導入することを含み、CRISPR-Cas3システムが以下の(A)～(C)を含む方法。
(A)Cas3タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
(B)カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
(C)crRNA、該crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項１】
ＤＮＡが編集された真核細胞（ただし、ヒト体内に存在する状態の細胞、ヒト生殖細胞、およびヒト胚細胞を除く）または動物（ただし、ヒトを除く）を製造する方法であって、真核細胞（ただし、ヒト体内に存在する状態の細胞、ヒト生殖細胞、およびヒト胚細胞を除く）または動物（ただし、ヒトを除く）に、真核細胞内または動物内でＤＮＡを編集できるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む方法（ただし、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムがタイプＩ－Ｄの場合を除く）。
（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｃ）プレｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
ＤＮＡが編集された植物を製造する方法であって、植物に、植物内でＤＮＡを編集できるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む方法（ただし、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムがタイプＩ－Ｄの場合を除く）。
（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｃ）プレｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
【請求項３】
真核細胞、動物、または植物にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを導入した後に、カスケードタンパク質を構成するタンパク質によりｃｒＲＮＡが切断される工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃａｓ３タンパク質および／またはカスケードタンパク質に核移行シグナルが付加されている、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
核移行シグナルがバイパルタイト核移行シグナルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡが編集された真核細胞または動物の製造に用いるためのキットであって、真核細胞内または動物内でＤＮＡを編集できるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを構成する以下の（Ａ）から（Ｃ）を含むキット（ただし、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムがタイプＩ－Ｄの場合を除く）。
（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｃ）プレｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド含む発現ベクター
【請求項７】
ＤＮＡが編集された植物の製造に用いるためのキットであって、植物内でＤＮＡを編集できるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを構成する以下の（Ａ）から（Ｃ）を含むキット（ただし、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムがタイプＩ－Ｄの場合を除く）。
（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｃ）プレｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド含む発現ベクター
【請求項８】
Ｃａｓ３タンパク質および／またはカスケードタンパク質に核移行シグナルが付加されている、請求項６または７に記載のキット。
【請求項９】
核移行シグナルがバイパルタイト核移行シグナルである、請求項８に記載のキット。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡが編集された真核細胞、動物、および植物を製造する方法、ならびに当該方法に用いられるキットに関する。
続きを表示（約 3,000 文字）【背景技術】
【０００２】
細菌、古細菌は、外来から侵入しようとするファージなどの生物を特異的に認識し、排除する適応免疫機構を有している。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと呼ばれるこのシステムは、まず、外来生物のゲノム情報を自己ゲノムに取り込む（アダプテーション）。そして、再度同じ外来生物が侵入しようとする際に、自己ゲノムに取り込まれた情報とゲノム配列の相補性を利用して外来ゲノムを切断し、排除する（インターフェアランス）。
【０００３】
最近になって、上記のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、「ＤＮＡ編集用の道具」として用いた、ゲノム編集（ＤＮＡ編集）技術が開発されるようになってきた（非特許文献１）。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＤＮＡを切断する過程で働くエフェクターが、複数のＣａｓからなる「クラス１」と、単一のＣａｓからなる「クラス２」とに大別される。とりわけ、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとしては、Ｃａｓ３およびカスケード複合体（カスケードとｃｒＲＮＡとの複合体を意味する。以下同様。）が関与する「タイプＩ」が広く知られており、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとしては、Ｃａｓ９が関与する「タイプＩＩ」が広く知られている（以下、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関して、「クラス１タイプＩ」および「クラス２タイプＩＩ」をそれぞれ単に「タイプＩ」および「タイプＩＩ」と称することもある。）。そして、これまでのＤＮＡ編集技術において広範に用いられていたのは、Ｃａｓ９が関与するクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである（以下、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム」と呼ぶこともある。）。例えば、非特許文献１は、Ｃａｓ９を用いてＤＮＡを切断する、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを報告している。
【０００５】
一方、Ｃａｓ３およびカスケード複合体を用いてＤＮＡを切断する、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（以下、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システム」と呼ぶこともある。）については、多くの努力にも拘らず、真核細胞においてゲノム編集の成功例の報告はなされていない。例えば、非特許文献２および３では、単に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを用いることにより、無細胞系で標的ＤＮＡが完全に分解されたことや、特定の大腸菌株を選択的に除去することができたことを報告しているが、これらはゲノム編集の成功を意味するものではなく、また、真核細胞では何ら実証されていない。また、特許文献１においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが、Ｃａｓ３のヘリカーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性により、大腸菌において標的ＤＮＡを分解してしまうことから（実施例５、図６）、真核細胞においては、Ｃａｓ３に代えて、ＦｏｋＩヌクレアーゼを用いてゲノム編集を行うことを提案している（実施例７、図７、図１１）。また、特許文献２では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、大腸菌において標的ＤＮＡを分解してしまうことから（図４）、ｃａｓ３を欠失させたり、不活性化されたＣａｓ３（Ｃａｓ３’とＣａｓ３’’）を使用することで、プログラム化可能な遺伝子抑制に再目的化することを提案している（例えば、実施例１５、請求項４（ｅ））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特表２０１５－５０３５３５号公報
特表２０１７－５１２４８１号公報
【非特許文献】
【０００７】
ＪｉｎｅｋＭｅｔａｌ．（２０１２）ＡＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＤｕａｌ－ＲＮＡＧｕｉｄｅｄＤＮＡＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎＡｄａｐｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉａｌＩｍｍｕｎｉｔｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３３７（Ｉｓｓｕｅ６０９６），ｐｐ．８１６－８２１
ＭｕｌｅｐａｔｉＳ＆ＢａｉｌｅｙＳ（２０１３）ＩｎＶｉｔｒｏＲｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆａｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄＩｍｍｕｎｅＳｙｓｔｅｍＲｅｖｅａｌｓＵｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ，ＡＴＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＤＮＡＴａｒｇｅｔ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８８（Ｎｏ．３１），ｐｐ．２２１８４－２２１９２
ＡｈｍｅｄＡ．Ｇｏｍａａｅｔａｌ．（２０１４）ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＲｅｏｍｏｖａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉａｌＳｔｒａｉｎｓｂｙＵｓｅｏｆＧｅｎｏｍｅＴａｒｇｅｔｉｎｇＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ，ｍｂｉｏ．ａｓｍ．ｏｒｇ，Ｖｏｌｕｍｅ５，Ｉｓｓｕｅ１，ｅ００９２８－１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、真核細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、遂に、真核細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを確立することに成功した。最も広く利用されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、様々な真核細胞においてゲノム編集に成功しているが、このシステムでは、通常、ｃｒＲＮＡとして成熟ｃｒＲＮＡが用いられている。しかしながら、驚くべきことに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムでは、成熟ｃｒＲＮＡを用いた場合には、真核細胞においてゲノム編集が困難であり、通常、システムの構成要素としては用いられないプレｃｒＲＮＡを用いることで初めて、効率的なゲノム編集が可能であった。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを真核細胞で機能させるためには、カスケードを構成するタンパク質によるｃｒＲＮＡの切断が重要であることが判明した。このプレｃｒＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、タイプＩ－Ｅのシステムのみならず、タイプＩ－ＦおよびタイプＩ－Ｇのシステムにも広く適用することが可能であった。また、Ｃａｓ３に核移行シグナル、特に、バイパルタイト核移行シグナルを付加することにより、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムのゲノム編集効率をさらに向上させることができた。また、本発明者は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによれば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと異なり、ＰＡＭ配列を含むか、その上流域において、大きな欠失をもたらすことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムに関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（【００１１】以降は省略されています）

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