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公開番号2025133756
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-09-11
出願番号2025101380,2022526270
出願日2025-06-17,2020-11-20
発明の名称スプリットインテインシステムを使用したタンパク質精製
出願人サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ
代理人個人,個人,個人
主分類C07K 14/00 20060101AFI20250904BHJP(有機化学)
要約【課題】先行技術の欠点を克服し、スプリットインテインシステムを使用したわずか1つの急速親和性クロマトグラフィー工程でタグなし/天然のタンパク質の一般的な精製を可能にする。
【解決手段】主にクロマトグラフィーの分野におけるタンパク質精製、より厳密には、本発明は向上したC-インテインタグ及びN-インテインリガンドによるスプリットインテインシステムを使用した親和性クロマトグラフィーを提供する。標的タンパク質は天然のN末端を有するタグなしの最終生成物として精製することができる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
天然のスプリットインテインの少なくとも1つのアミノ酸置換を含むN-インテイン変異体であって、最初の触媒システインから測定したときN-インテインタンパク質変異体配列は少なくとも36位にアスパラギン(N)を含まず、置換アミノ酸は天然のN-インテインタンパク質配列又は共通N-インテイン配列と比較して増加したアルカリ安定性を提供する、N-インテイン変異体。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にクロマトグラフィーの分野におけるタンパク質精製に関する。より厳密には、本発明は向上したC-インテインタグ及びN-インテインリガンドによるスプリットインテインシステムを使用した親和性クロマトグラフィーに関し、ここで、標的タンパク質は天然のN末端を有するタグなしの最終生成物として精製することができる。
続きを表示（約 2,300 文字）【背景技術】
【０００２】
インテインは、酵素配列を中断し、それら自身の切り出し及び2つの隣接ポリペプチドのライゲーションを触媒して活性タンパク質を生成する、インフレーム挿入物として発現されるタンパク質エレメントである。遺伝子的に、インテインは、2つの隣接エクステイン配列を中断する無傷のインテインとしてか、又は各エクステイン及びインテインの一部が2つの異なる遺伝子によってコードされるスプリットインテインとしての、2つの異なる様式でコードされる。それらには生物工学及びタンパク質精製ツールとして大きな将来性があるが、天然に見出される急速動態特性を有するスプリットインテインはインテイン-エクステイン接合部での特異的アミノ酸に依存し、天然タンパク質配列の親和性精製及び回収のためにインテインへ融合させることができるタンパク質を厳しく制限する。特に、ネンジュモ(Nostoc punctiforme)からの典型的なスプリットインテインDNAEは、タンパク質精製への適用のために好適な動態特性を示す。しかし、その活性は、C-エクステインの+2位のフェニルアラニンに依存する。この依存性は、その一般的な適用性を厳しく制限し、損なう。
【０００３】
インテインは、組換えタンパク質精製のための自己切断タンパク質としての適用を含む、バイオテクノロジーにおけるいくつかの重要な機能を達成するように工学操作されている。スプリットインテインは親和性リガンド及び自己切断特性を同時に提供することができるので、この点に関して特に有望である。タンパク質精製では、精製の対象である標的タンパク質をいずれかのエクステインで置換することができる。今日まで、DNAEファミリーのスプリットインテインがC末端切断タンパク質精製アプローチで最も大きな将来性を示している。
【０００４】
WO2014/004336は、支持体に結合させることができるスプリットインテインのN断片及びスプリットインテインのC断片に融合されるタンパク質を記載する。固体支持体は、粒子、ビーズ、樹脂又はスライドであってよい。
【０００５】
WO2014/110393は、スプリットインテインのN断片及び精製タグと接触させるスプリットインテインC断片に融合される目的のタンパク質を記載する。N断片は精製タグを介して固体相に結合することができ、親和性精製の方法が議論される。
【０００６】
米国特許仮出願第10 066027号は、タンパク質精製システム及びこのシステムを使用する方法を記載する。固定化することができるN末端インテインセグメント、及び自己切断する特性を有し、目的のタンパク質に結合することができるC末端のインテインセグメントを含むスプリットインテインが開示される。N末端のインテインセグメントは、それを外因性の状態により感受性にする感受性増強モチーフが提供される。
【０００７】
米国特許仮出願第10 308 679号は、N-インテインポリペプチド及びN-インテイン可溶化パートナーを含む融合タンパク質、並びにそのような融合タンパク質を含む親和性マトリックスを記載する。
【０００８】
WO 2018/091424は、アミノ末端基(N末端)、親和性リガンドとしてのスプリットインテイン断片を含む親和性クロマトグラフィー樹脂の生成方法であって、以下の工程を含む方法を記載する: a)細菌細胞、好ましくは大腸菌(E.coli)の封入体の中での不溶性タンパク質としてのN末端スプリットインテイン断片タンパク質の発現、b)前記封入体を採取すること; c)前記封入体を可溶化して発現されるタンパク質を放出させること; d)前記タンパク質を固体支持体の上に結合させること; e)前記タンパク質をリフォールディングさせること; f)前記タンパク質を固体支持体から放出させること;及びg)クロマトグラフィー樹脂の上に前記タンパク質をリガンドとして固定化して親和性クロマトグラフィー樹脂を形成すること。この手順は、2～10mg/ml樹脂のリガンド密度の固定化を可能にする。
【０００９】
上記の通り、スプリットインテインは、複合的親和性タグ及びタグ切断機構を使用したタンパク質精製のために使用されている。しかし、そのようなシステムの有用性はいくつかの因子によって制限される。第1に、タグなしのタンパク質の切断を実行し、精製を達成するために、目的の生成物のスプライス接合部でのアミノ酸要件、すなわちC-エクステインの+2位におけるPheの必要性がある。N末端に無関係なアミノ酸のない組換えタンパク質の生成が非常に望ましい。第2に、タンパク質を放出する切断は十分に速く、許容される収量を提供しなければならない。第3に、固体支持体へのその結合のためにスプリットインテインのN-又はC-断片の溶解性要件がある。第4に、タグなしのタンパク質の大規模精製に好適である利用可能なスプリットインテインシステムは、これまでのところ存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
WO2014/004336
WO2014/110393
米国特許仮出願第10 066027号
米国特許仮出願第10 308 679号
WO 2018/091424
【非特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

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