発明の詳細な説明【技術分野】 【０００１】 本願は、多能性幹細胞から体節細胞の製造方法に関する。本願はまた、多能性幹細胞から製造された体節細胞を更に分化誘導することにより、多能性幹細胞から筋節細胞、真皮節細胞、硬節細胞、靱帯節細胞および間葉系間質細胞を製造する方法に関する。本願はまた、体節細胞から真皮節細胞、靱帯節細胞および間葉系間質細胞を製造する方法に関する。 続きを表示（約 5,700 文字）【背景技術】 【０００２】 内因性シグナル伝達環境の再現は、多能性幹細胞（pluripotent stem cells, ＰＳＣ）からの所望の細胞種の誘導に重要だと考えられている。発生生物学の知見に基づいて、アクチビン／Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβシグナル伝達が、多能性幹細胞から中内胚葉への分化を誘導し、ＢＭＰシグナル伝達が多能性幹細胞から中胚葉への分化を誘導し、これらのシグナルの妨害が神経細胞を誘導することがわかっている(非特許文献１～４）。 【０００３】 注目すべきことに、アクチビン／Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβシグナル伝達およびＢＭＰシグナル伝達で誘導された中胚葉は、沿軸中胚葉（神経管と側板中胚葉との間に形成される、中胚葉のサブ集団）ではなく、主に側板中胚葉（中胚葉の側部（腹部）のサブ集団）からなることが報告されている。いくつかの治験が、アクチビン／Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβに基づくプロトコルの改変によって沿軸中胚葉を誘導するために行われたが、誘導の比率は相対的に低い（約２０％）ままであったと報告されている(非特許文献５)。 【０００４】 近年、いくつかのグループが、異なる考えに基づく沿軸中胚葉の誘導の成功を報告している(非特許文献６～９)。これらの報告では、神経（背側）となる運命へ誘導するため、細胞をアクチビン／Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβを含まない処理、またはＴＧＦβ阻害剤を含む処理を行っており、さらに相対的に高濃度のＧＳＫ３阻害剤（ＷＮＴシグナル伝達活性化剤）を用いている。これらのプロトコルを用いることで、沿軸中胚葉の誘導率は、約７０～９５％に達した(非特許文献７および９）。この神経から沿軸中胚葉への変換は、胚形成において神経と沿軸中胚葉に共通の前駆体が存在することを示唆する(非特許文献１０および１１）。これらの前駆体は神経中胚葉前駆体または軸性中胚葉と呼ばれる。この理論は、Ｗｎｔ３ａノックアウトマウスにおいて、沿軸中胚葉の消失の代わりに異所性（二次）神経管の形成が認められる事実(非特許文献１２および非特許文献１２）によっても支持される。 【０００５】 沿軸中胚葉およびその先の分化の誘導は達成できたが、依然として対処すべきいくつかの問題がある。脊椎動物の発生の過程において、沿軸中胚葉はまず、未分節中胚葉（ＰＳＭ）を後方に、体節（ＳＭ）を前方に形成する。体節は最終的に、背側が皮筋節（ＤＭ）に、腹側が硬節に分化する。皮筋節は真皮の前駆体である真皮節（Ｄ）および骨格筋の前駆体である筋節（ＭＹＯ）を生じ、硬節のサブ集団は、腱および靱帯の前駆体である靱帯節を形成する(非特許文献１４)。多能性幹細胞から誘導された体節細胞が完全なものであるというためには、誘導された体節細胞が、真皮節細胞、筋節細胞、硬節細胞および靱帯節細胞への分化能を示すことが重要である。上述の報告は、筋節細胞および硬節細胞の誘導には成功しているが、真皮節細胞および靱帯節細胞における誘導プロトコルは、未だ確立されていない。さらに、側板中胚葉は間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の主要な供給源である(非特許文献１５)が、体節細胞もまた、間葉系間質細胞の供給源になり得る。しかしながら、多能性幹細胞から、沿軸中胚葉を介して間葉系間質細胞を誘導した報告はない。 【先行技術文献】 【非特許文献】 【０００６】 Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. 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BMC developmental biology 15, 44. 【発明の概要】 【発明が解決しようとする課題】 【０００７】 本願は多能性幹細胞から体節細胞を製造する方法を提供することを目的とする。本願の別の目的は、体節細胞から真皮節細胞を製造する方法を提供することである。本願の更に別の目的は、体節細胞から靱帯節細胞を誘導する方法を提供することである。本願の更に別の目的は、体節細胞から間葉系間質細胞を誘導する方法を提供することである。 【０００８】 本願はまた、多能性幹細胞から体節細胞を分化誘導し、体節細胞をさらに筋節細胞、真皮節細胞、硬節細胞および靱帯節細胞、並びに間葉系間質細胞へそれぞれ分化誘導することにより、多能性幹細胞から筋節細胞、真皮節細胞、硬節細胞、靱帯節細胞および間葉系間質細胞を誘導する方法を提供することを目的とする。 【課題を解決するための手段】 【０００９】 本願の方法の全容（但し間葉系間質細胞の製造以外）を図１に示す。多能性幹細胞から、インビトロで未分節中胚葉（ＰＳＭ）を介して体節細胞（ＳＭ）を製造した。得られた体節細胞は、生体において体節から更に分化誘導されることが知られている、真皮節（Ｄ）、筋節（ＭＹＯ）、硬節（ＳＣＬ）および靱帯節（ＳＹＮ）それぞれに段階的にインビトロで分化させることができた。各誘導プロトコルを、決定した。なお、この図は、論文(Buckingham et al., 2003)から改変した図である。 【００１０】 本願は多能性幹細胞を提供する工程、および 多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から体節細胞を製造する方法を提供する。本態様において、多能性幹細胞をＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程は好ましくは、 （１）多能性幹細胞をＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して未分節中胚葉細胞培養物を得る工程、および （２）未分節中胚葉細胞培養物を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して体節細胞培養物を得る工程を含んでいる。 （【００１１】以降は省略されています） この特許をJ-PlatPatで参照する
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