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公開番号2025097299
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-30
出願番号2024214031
出願日2024-12-06
発明の名称組換え水素酸化細菌、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
出願人国立大学法人東京科学大学,帝人株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 1/21 20060101AFI20250623BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】第2成分の前駆体を使用せずに、第2成分の導入分率が強化された共重合PHAの製造方法の提供。
【解決手段】モノマー供給強化遺伝子として少なくとも2-ケト酸デカルボキシラーゼ(kivd)遺伝子及びフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(padA)遺伝子を有し、共重合ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)生産能を有する、組換え水素酸化細菌;及び、ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)の製造方法であって、
(i)モノマー供給強化遺伝子として少なくとも2-ケト酸デカルボキシラーゼ(kivd)遺伝子及びフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(padA)遺伝子を、PHA重合酵素を有する水素酸化細菌に導入して、前記水素酸化細菌の形質転換体を得る工程、
(ii)得られた形質転換体を炭素源の存在下に培養する工程、及び
(iii)培養物から共重合PHAを採取する工程
を含む、製造方法。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
モノマー供給強化遺伝子として少なくとも２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）遺伝子及びフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｐａｄＡ）遺伝子を有し、共重合ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生産能を有する、組換え水素酸化細菌。
続きを表示（約 960 文字）【請求項２】
モノマー供給強化遺伝子として３－ケトチオラーゼ（ｂｋｔＢ）遺伝子をさらに有する、請求項１に記載の組換え水素酸化細菌。
【請求項３】
前記共重合ＰＨＡ中の第２成分の導入分率が、いずれのモノマー供給強化遺伝子も有しない水素酸化細菌によって製造された共重合ＰＨＡ中の当該第２成分の導入分率と比べて高い、請求項１に記載の組換え水素酸化細菌。
【請求項４】
前記第２成分の導入分率が少なくとも１ｍｏｌ％である、請求項３に記載の組換え水素酸化細菌。
【請求項５】
前記第２成分が、３－ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）及び／又は３－ヒドロキシ－４－メチル吉草酸（３Ｈ４ＭＶ）である、請求項３に記載の組換え水素酸化細菌。
【請求項６】
前記水素酸化細菌が、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）である、請求項１に記載の組換え水素酸化細菌。
【請求項７】
前記モノマー供給強化遺伝子を水素酸化細菌のゲノムＤＮＡに有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換え水素酸化細菌。
【請求項８】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の製造方法であって、
（ｉ）モノマー供給強化遺伝子として少なくとも２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）遺伝子及びフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｐａｄＡ）遺伝子を、ＰＨＡ重合酵素を有する水素酸化細菌に導入して、前記水素酸化細菌の形質転換体を得る工程、
（ii）得られた形質転換体を炭素源の存在下に培養する工程、及び
（iii）培養物から共重合ＰＨＡを採取する工程
を含む、製造方法。
【請求項９】
前記工程（ｉ）において、モノマー供給強化遺伝子として３－ケトチオラーゼ（ｂｋｔＢ）遺伝子をさらに導入する、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記モノマー供給強化遺伝子が、水素酸化細菌のゲノムＤＮＡに直接組み込むことによって導入されるか、又は、当該遺伝子を有するプラスミドの水素酸化細菌への導入によって導入される、請求項８に記載の製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のモノマー供給強化遺伝子を有する共重合ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生産能を有する組換え水素酸化細菌に関する。また、本発明は、当該モノマー供給強化遺伝子を導入した、ＰＨＡ重合酵素を有する組換え水素酸化細菌を用いるＰＨＡの製造方法に関する。
続きを表示（約 3,800 文字）【背景技術】
【０００２】
３－ヒドロキシアルカン酸のホモポリマー又は共重合体であるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、微生物が細胞内に蓄積するバイオポリエステルである。近年では、生分解性プラスチック素材としてのみならず、バイオマス由来のプラスチック素材として注目されている。
【０００３】
最も一般的なＰＨＡである、（Ｒ）－３－ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）を構成成分とするホモポリマー（以下、適宜、「Ｐ（３ＨＢ）」と表記）は結晶性であるため、加工時間を短縮できる一方、硬くて脆く、実用性に乏しい。また、溶融時にポリマーが低分子量化してしまうなど成型加工時の劣化が問題となり、工業生産には向いていない。この物性を改善する手段の一つとして、３ＨＢと他のモノマーとの共重合体（以下、ＰＨＡの共重合体を、適宜、「共重合ＰＨＡ」と表記）が種々開発されてきた。
【０００４】
例えば、３ＨＢに加えて第２成分として３－ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）及び３－ヒドロキシ－４－メチル吉草酸（３Ｈ４ＭＶ）を含む共重合ＰＨＡは、柔軟な物性を有する。当該共重合ＰＨＡは、水素酸化細菌にプロピオン酸や４－メチル吉草酸を前駆体として供給することによって生合成される。
【０００５】
具体的には、本発明者らは、４－メチル吉草酸を前駆体として、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）６１－３株由来のＰＨＡ重合酵素（ＰｈａＣ１
Ｐｓ
）遺伝子を導入した水素酸化細菌ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）ＰＨＢ
－
４株を培養して、共重合ＰＨＡであるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ－ｃｏ－３Ｈ４ＭＶ）を生合成している（非特許文献１）。また、本発明者らは、ロイシンを前駆体として、当該ラルストニア・ユートロファＰＨＢ
－
４株を培養して、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ－ｃｏ－３Ｈ４ＭＶ）を生合成している（非特許文献２）。
【０００６】
しかしながら、４－メチル吉草酸などの前駆体は一般に高価である。また、一般に、細胞に対して毒性が高いために、細胞成長を阻害し、微生物におけるＰＨＡ蓄積を低下させる。遺伝子組換え水素酸化細菌を用いることにより、前駆体なしに、糖や二酸化炭素を単一炭素源として３ＨＶ及び３Ｈ４ＭＶを含む共重合ＰＨＡを生合成することも可能であるが、当該モノマー成分の導入分率が１～２ｍｏｌ％と低い（非特許文献３、４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
Tanadchangsaeng N, Kitagawa A, Yamamoto T, Abe H, Tsuge T (2009), Biomacromolecules. 10: 2866-2874）
Saika A, Watanabe Sudesh K, Abe H, Tsuge T (2011), AMB Express, 1:6
Miyahara Y, Yamamoto M, Thorbecke R, Mizuno S, Tsuge T （2020）, Biotechnol. Lett., 42, 1655-1662
Saika A, Ushimaru K, Mizuno S, Tsuge T （2015）, J Bacteriol 197:1350-1359
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、第２成分の前駆体を使用せずに、第２成分の導入分率が強化された共重合ＰＨＡの製造方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、斯かる実状に鑑み鋭意検討した結果、ＰＨＡ生合成経路に係る少なくとも特定の２つのモノマー供給強化遺伝子を有する水素酸化細菌を作製し、炭素源存在下に当該組換え水素酸化細菌を培養することにより、第２成分の前駆体を使用しなくても、第２成分の導入分率が強化された共重合ＰＨＡを製造することができることを見出し、本発明を完成させた。特に、本発明者らは、特定の３つのモノマー供給強化遺伝子を有する水素酸化細菌が、第２成分の導入分率が強化され、かつＰＨＡの生産性が増加した共重合ＰＨＡを製造することができることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）モノマー供給強化遺伝子として少なくとも２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）遺伝子及びフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｐａｄＡ）遺伝子を有し、共重合ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生産能を有する、組換え水素酸化細菌。
（２）モノマー供給強化遺伝子として３－ケトチオラーゼ（ｂｋｔＢ）遺伝子をさらに有する、（１）に記載の組換え水素酸化細菌。
（３）前記共重合ＰＨＡ中の第２成分の導入分率が、いずれのモノマー供給強化遺伝子も有しない水素酸化細菌によって製造された共重合ＰＨＡ中の当該第２成分の導入分率と比べて高い、（１）又は（２）に記載の組換え水素酸化細菌。
（４）前記第２成分の導入分率が少なくとも１ｍｏｌ％である、（３）に記載の組換え水素酸化細菌。
（５）前記第２成分が、３－ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）及び／又は３－ヒドロキシ－４－メチル吉草酸（３Ｈ４ＭＶ）である、（３）又は（４）に記載の組換え水素酸化細菌。
（６）前記水素酸化細菌が、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）である、（１）～（５）のいずれか１に記載の組換え水素酸化細菌。
（７）前記モノマー供給強化遺伝子を水素酸化細菌のゲノムＤＮＡに有する、（１）～（６）のいずれか１に記載の組換え水素酸化細菌。
（８）ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の製造方法であって、
（ｉ）モノマー供給強化遺伝子として少なくとも２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）遺伝子及びフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｐａｄＡ）遺伝子を、ＰＨＡ重合酵素を有する水素酸化細菌に導入して、前記水素酸化細菌の形質転換体を得る工程、
（ii）得られた形質転換体を炭素源の存在下に培養する工程、及び
（iii）培養物から共重合ＰＨＡを採取する工程
を含む、製造方法。
（９）前記工程（ｉ）において、モノマー供給強化遺伝子として３－ケトチオラーゼ（ｂｋｔＢ）遺伝子をさらに導入する、（８）に記載の製造方法。
（１０）前記モノマー供給強化遺伝子が、水素酸化細菌のゲノムＤＮＡに直接組み込むことによって導入されるか、又は、当該遺伝子を有するプラスミドの水素酸化細菌への導入によって導入される、（８）又は（９）に記載の製造方法。
（１１）前記モノマー供給強化遺伝子が、水素酸化細菌のゲノムＤＮＡに直接組み込むことによって導入される、（１０）に記載の製造方法。
（１２）前記ＰＨＡ重合酵素を有する水素酸化細菌が、水素酸化細菌に広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子を導入することによって得られる、（８）～（１１）のいずれか１に記載の製造方法。
（１３）前記炭素源が糖又は二酸化炭素である、（８）～（１２）のいずれか１に記載の製造方法。
（１４）前記糖がフルクトースである、（１３）に記載の製造方法。
（１５）前記二酸化炭素が、二酸化炭素を１～２０％（ｖ／ｖ）の範囲で含む混合ガスである、（１３）に記載の製造方法。
（１６）前記工程（ii）において、第２成分の前駆体を添加しない、（８）～（１５）のいずれか１に記載の製造方法。
（１７）前記共重合ＰＨＡ中の第２成分の導入分率が、いずれのモノマー供給強化遺伝子も導入されていない水素酸化細菌によって製造された共重合ＰＨＡ中の当該該第２成分の導入分率と比べて高い、（８）～（１６）のいずれか１に記載の製造方法。
（１８）前記第２成分が、３－ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）及び／又は３－ヒドロキシ－４－メチル吉草酸（３Ｈ４ＭＶ）である、（１７）に記載の製造方法。
（１９）前記水素酸化細菌が、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）である、（８）～（１８）のいずれか１に記載の製造方法。
（２０）前記ＰＨＡ重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎｃａｖｉａｅ）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の１４９番のアスパラギンがセリンに、かつ１７１番のアスパラギン酸がグリシンに置換されたＰＨＡ重合酵素変異体（ＮＳＤＧ）、又はプレジオモナス・シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）由来のＰＨＡ重合酵素（Ｐｓｈ）をコードするものである、（８）～（１９）のいずれか１に記載の製造方法。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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