特許ウォッチ

公開番号2025071848
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-09
出願番号2023182220
出願日2023-10-24
発明の名称ヌクレオシド三リン酸の製造方法
出願人国立大学法人東京科学大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12P 9/00 20060101AFI20250430BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】NMP又はNDPからNTPを製造する技術を提供する。
【解決手段】ヌクレオシド一リン酸(NMP)又はヌクレオシド二リン酸(NDP)、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼを含む反応液をインキュベートする工程であって、その結果、前記NMP又は前記NDPがヌクレオシド三リン酸(NTP)に変換される工程を含み、前記ポリリン酸キナーゼが、Mangrovibacterium marinum由来のポリリン酸キナーゼ(MAN)である、NTPの製造方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）又はヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼを含む反応液をインキュベートする工程であって、その結果、前記ＮＭＰ又は前記ＮＤＰがヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）に変換される工程を含み、
前記ポリリン酸キナーゼが、Ｍａｎｇｒｏｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｒｉｎｕｍ由来のポリリン酸キナーゼ（ＭＡＮ）である、ＮＴＰの製造方法。
続きを表示（約 390 文字）【請求項２】
前記反応液が、２価金属イオンを更に含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記インキュベートする工程を１０～６０℃で行う、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
ＮＭＰ又はＮＤＰ、ポリリン酸、ポリリン酸キナーゼ、鋳型ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼを含む反応液をインキュベートする工程であって、前記ポリリン酸キナーゼがＭＡＮであり、その結果、前記ＮＭＰ又は前記ＮＤＰがＮＴＰに変換され、更に前記ＮＴＰを基質として前記ＲＮＡポリメラーゼが前記鋳型ＤＮＡを転写してＲＮＡが生成される工程を含む、ＲＮＡの製造方法。
【請求項５】
前記反応液が、２価金属イオンを更に含む、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記インキュベートする工程を１０～６０℃で行う、請求項４又は５に記載の製造方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオシド三リン酸（ヌクレオシド－５’－三リン酸、ＮＴＰ）の製造方法に関する。
続きを表示（約 2,700 文字）【背景技術】
【０００２】
ポリリン酸キナーゼは、大腸菌においてはじめてその存在が明らかにされた酵素であり、現在では様々な微生物ゲノム上にポリリン酸キナーゼ遺伝子のホモログが存在していることが明らかとなっている。
【０００３】
ポリリン酸キナーゼには、ポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）とポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）が存在する。ＰＰＫ１は、アデノシン－５’－三リン酸（ＡＴＰ）の末端リン酸基を短鎖ポリリン酸に転移し、長鎖ポリリン酸を生成する酵素である。ＰＰＫ１は、この逆反応も触媒するが、優先的にポリリン酸の生成を触媒することが知られている。
【０００４】
ＰＰＫ２は、ＰＰＫ１とは対照的に、優先的に核酸のリン酸化を触媒することが知られている。ＰＰＫ２は、３つのサブファミリーに分類されている。ＰＰＫ２クラスＩに属する酵素は、ヌクレオシド－５’－二リン酸（ＮＤＰ）のヌクレオシド－５’－三リン酸（ＮＴＰ）へのポリリン酸依存性リン酸化を触媒することが知られている。ＰＰＫ２クラスＩＩに属する酵素は、ヌクレオシド－５’－一リン酸（ＮＭＰ）のヌクレオシド－５’－二リン酸（ＮＤＰ）へのポリリン酸依存性リン酸化を触媒することが知られている。ＰＰＫ２クラスＩＩＩに属する酵素は、ＮＭＰ及びＮＤＰの双方のリン酸化を触媒することが知られている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Motomura K., et al., A New Subfamily of Polyphosphate Kinase 2 (Class III PPK2) Catalyzes both Nucleoside Monophosphate Phosphorylation and Nucleoside Diphosphate Phosphorylation, Applied and Environmental Microbiology, 80 (8), 2602-2608, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＮＭＰ（アデノシン－５’－一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン－５’－一リン酸（ＧＭＰ）、シチジン－５’－一リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン－５’－一リン酸（ＵＭＰ））が比較的安価であるのに対し、ｍＲＮＡワクチン等の原料となるＮＴＰ（アデノシン－５’－三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン－５’－三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン－５’－三リン酸（ＵＴＰ））は、高価であり、海外からの輸入に頼っている状況である。本発明は、ＮＭＰ又はＮＤＰからＮＴＰを製造する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ヌクレオシド一リン酸（ヌクレオシド－５’－一リン酸、ＮＭＰ）又はヌクレオシド二リン酸（ヌクレオシド－５’－二リン酸、ＮＤＰ）、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼを含む反応液をインキュベートする工程であって、その結果、前記ＮＭＰ又は前記ＮＤＰがヌクレオシド三リン酸（ヌクレオシド－５’－三リン酸、ＮＴＰ）に変換される工程を含み、前記ポリリン酸キナーゼが、Ｍａｎｇｒｏｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｒｉｎｕｍ由来のポリリン酸キナーゼ（ＭＡＮ）である、ＮＴＰの製造方法。
［２］前記反応液が、２価金属イオンを更に含む、［１］に記載の製造方法。
［３］前記インキュベートする工程を１０～６０℃で行う、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ＮＭＰ又はＮＤＰ、ポリリン酸、ポリリン酸キナーゼ、鋳型ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼを含む反応液をインキュベートする工程であって、前記ポリリン酸キナーゼがＭＡＮであり、その結果、前記ＮＭＰ又は前記ＮＤＰがＮＴＰに変換され、更に前記ＮＴＰを基質として前記ＲＮＡポリメラーゼが前記鋳型ＤＮＡを転写してＲＮＡが生成される工程を含む、ＲＮＡの製造方法。
［５］前記反応液が、２価金属イオンを更に含む、［４］に記載の製造方法。
［６］前記インキュベートする工程を１０～６０℃で行う、［４］又は［５］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＮＭＰ又はＮＤＰからＮＴＰを製造する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、実験例２において、ポリリン酸キナーゼ（ＭＡＮ）及びポリリン酸キナーゼ（ＣＨＵ）に、ＡＭＰを反応させた場合のＨＰＬＣ測定結果のクロマトグラムである。
図２は、実験例２における、ＭＡＮ及びＣＨＵの酵素活性の測定結果をまとめたグラフである。
図３は、実験例３における、ＭＡＮの酵素活性の測定結果をまとめたグラフである。
図４は、実験例４において測定したＨＰＬＣクロマトグラムから算出した、各ヌクレオチド（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＡＰ４、ＡＰｎ）の面積比を示すグラフである。
図５は、実験例５において測定したＨＰＬＣクロマトグラムから算出した各ヌクレオチド（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＡＰ４、ＡＰｎ）の面積比を示すグラフである。
図６は、実験例６において測定したＨＰＬＣクロマトグラムから算出した各ヌクレオチド（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＡＰ４）の面積比を示すグラフである。
図７は、実験例７において測定したＨＰＬＣクロマトグラムから算出した各ヌクレオチド（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＡＰ４）の面積比を示すグラフである。
図８は、実験例７において測定した、波長５１６ｎｍの蛍光の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［ＮＴＰの製造方法］
一実施形態において、本発明は、ＮＭＰ又はＮＤＰ、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼを含む反応液をインキュベートする工程であって、その結果、前記ＮＭＰ又は前記ＮＤＰがＮＴＰに変換される工程を含み、前記ポリリン酸キナーゼが、Ｍａｎｇｒｏｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｒｉｎｕｍ由来のポリリン酸キナーゼ（ＭＡＮ）である、ＮＴＰの製造方法を提供する。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許