特許ウォッチ

公開番号2025066728
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-23
出願番号2024231843,2023042508
出願日2024-12-27,2016-09-16
発明の名称アネキシンVの製造プロセス
出願人アネキシンファーマシューティカルズアーベー
代理人園田・小林弁理士法人
主分類C07K 14/47 20060101AFI20250416BHJP(有機化学)
要約【課題】アネキシンA5(AnxA5)の配列を含むタンパク質の製造のためのプロセスを提供する。
【解決手段】アネキシンA5(AnxA5)の配列を含む組換え的に発現された細胞内タンパク質の、細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞からの回収及び/または精製のためのプロセスであって、該プロセスは、該細胞内タンパク質を該宿主細胞から放出させることを含み、該細胞内AnxA5タンパク質を放出させる工程が、非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施されることを特徴とし、好ましくは、該プロセスは、AnxA5タンパク質の該宿主細胞からの放出後に、その回収及び/または精製のためにいかなる遠心分離工程も含まず、かつ/またはAnxA5タンパク質は、任意のクロマトグラフ樹脂に一時的に結合した場合を除いて該プロセス全体を通して溶液中にとどまる、プロセスとする。
【選択図】図2
特許請求の範囲【請求項１】
アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含む組換え的に発現された細胞内タンパク質の、細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、前記プロセスは、前記細胞内タンパク質を前記宿主細胞から放出させることを含み、
前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる前記工程が、非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施されることを特徴とし、
好ましくは、前記プロセスは、前記ＡｎｘＡ５タンパク質の前記宿主細胞からの放出後に、その前記回収及び／または精製のためにいかなる遠心分離工程も含まず、かつ／または前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、任意のクロマトグラフ樹脂に一時的に結合した場合を除いて前記プロセス全体を通して溶液中にとどまる、プロセス。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
前記非イオン性洗剤は、ポリソルベート、好ましくはＴｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０から選択されるポリソルベート、最も好ましくはＴｗｅｅｎ８０である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる前記工程は、アネキシンＡ５と内毒素との間の前記結合を低減するまたは防止するのに有効な量の非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施される、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる前記工程は、０．０１～１０％（ｗ／ｗ）非イオン性洗剤、例えば、０．０２～５％（ｗ／ｗ）、０．０５～２％（ｗ／ｗ）、または約１％（ｗ／ｗ）非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施される、請求項１～３のいずれかに記載のプロセス。
【請求項５】
前記プロセスは、前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を前記宿主細胞から放出させることを含み、
前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を前記宿主細胞から放出させる時点での、または前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を前記宿主細胞から放出させた後であるが、いずれのさらなるクロマトグラフ精製が行われる前の、前記ホモジナイゼーション緩衝液中の遊離カルシウムイオン濃度は、１０ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭ、１ｍＭ未満、より好ましくは５００μＭ未満、または実質的にゼロであり、かつ／あるいは
前記ホモジナイゼーション緩衝液は、前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させた後にカルシウム金属イオンキレート剤を含むか、またはそれを含むように改変される、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含む組換え的に発現された細胞内タンパク質の、細胞壁を有する宿主細胞からの回収及び／または精製のための請求項１～４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項６】
前記カルシウム金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡまたはその塩、ＥＧＴＡまたはその塩から選択され、最も好ましくはＥＤＴＡである、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
遊離カルシウムイオンのレベル、及び／またはカルシウム金属イオンキレート剤の量は、アネキシンＡ５と前記宿主細胞の前記細胞壁の構成成分との間の前記結合を低減するまたは防止するのに有効である、請求項５または６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記ホモジナイゼーション緩衝液は、（前記ＡｎｘＡ５タンパク質の前記放出の前または後に）０．０１～５００ｍＭ、例えば、０．０５～１００ｍＭ、０．５～２０ｍＭ、１～１５ｍＭ、２～１０ｍＭ、または約４ｍＭカルシウム金属イオンキレート剤を含むか、またはそれを含むように調整され、好ましくは、前記カルシウム金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡである、請求項５～７のいずれかに記載のプロセス。
【請求項９】
前記ホモジナイゼーション緩衝液は、請求項２、３または４のいずれかに記載のプロセスに従った非イオン性洗剤を含む、請求項５、６、７または８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記カルシウム金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡである、請求項９に記載のプロセス。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本出願は、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の製造のためのプロセスに関する。より特定すると、本プロセスは、ＡｎｘＡ５タンパク質の、とりわけ細菌宿主細胞などの組換え宿主細胞からの回収及び／または精製のためのものである。本明細書に記載されるプロセスは、非常に効率的かつ費用効果あり、薬品グレードのＡｎｘＡ５タンパク質生成物を迅速かつ好都合に生産するために商業規模で（例えば、約１０００Ｌ以上の培養体積を有する組換え宿主細胞培養物で）使用することができる。
続きを表示（約 4,300 文字）【背景技術】
【０００２】
先行公開されたと思われる文献の本明細書での列挙または考察は、必ずしも、その文献が最新技術の一部であること、または共通一般知識であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
【０００３】
根底にある動脈硬化巣から形成される、アテローム性血栓症は、急性冠動脈疾患、脳血管及び末梢動脈閉塞症を含む、臨床的に明らかな虚血性心血管疾患の大多数の裏に潜む主要な病原性機構である。ＣｅｄｅｒｈｏｌｍａｎｄＦｒｏｓｔｅｇａｒｄ，２００７，ＤｒｕｇＮｅｗｓＰｅｒｓｐｅｃｔ．，２０（５）：３２１－６で考察されるように、アネキシンスーバーファミリーのメンバーである、アネキシンＡ５（以前はアネキシンＶとして知られた）は、強力かつ独特の抗血栓性特性を備えたタンパク質である。アネキシンＡ５が発揮する抗血栓効果は、リン脂質、特にホスファチジルセリンの機械的遮蔽により、凝固反応へのそれらの可用性を低減することによって、主に媒介されると考えられている。しかしながら、その抗血栓機能に潜在的に寄与するアネキシンＡ５の他の興味深い特性、とりわけ、表面で発現される組織因子の下方制御、またはスルファチド及びヘパリンなどのホメオスタシスに関与する追加のリガンドとの相互作用、ならびにウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の上方制御が報告された。大きな脈管構造及び胎盤微小循環に対する体内での内因性抗血栓性系のメンバーとしてのアネキシンＡ５の生物学的重要性もまた示唆されてきた。
【０００４】
実際、アネキシンＡ５は、薬品において、直接的な治療効果を提供する上での広範な有用性を有することが知られている。例としては、アネキシンＡ５の下記の使用が挙げられる。
ＷＯ２００５／０９９７４４に記載されるようなアテローム性血栓症及び／またはプラーク破裂の予防のため（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、
ＷＯ２００９／０７７７６４に記載されるような血管機能不全の治療、虚血性疼痛の低減及び／または血管疾患の治療のため（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、
ＷＯ２００９／１０３９７７に記載されるような再狭窄の予防または治療のため（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、
ＷＯ２０１０／０６９６０５に記載されるような、酸化カルジオリピン（ｏｘＣＬ）の活性の阻害において使用するため、及び心血管疾患、自己免疫疾患または炎症性病態を治療する、予防する及び／またはその発症のリスクを低減するため（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに
ＷＯ２０１２／１３６８１９に記載されるような、血管手術、とりわけ末梢血管手術後の合併症などの、外科的介入後の周術期または術後合併症の予防及び／または低減のため（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００５】
かくして、アネキシンＡ５は、治療上の関心及び可能性が高いタンパク質を代表する。したがって、（例えば、アネキシンＡ５タンパク質を、約１０００Ｌ以上の培養体積を有する組換え宿主細胞培養物から収集するために）商業規模の生産に合わせて規模拡大し、それに好都合に適用することができる効率的かつ費用効果のあるプロセスによって、治療グレードのアネキシンＡ５タンパク質を生産するための有効な方法が、差し迫って必要とされている。
【０００６】
Ｅ．ｃｏｌｉなどの標準的な細菌宿主細胞においてアネキシンＡ５を組換え的に発現させる際の特定の課題は、宿主細胞由来の構成成分による、特に内毒素による汚染である。内毒素は、共有結合によって連結された脂質ならびにＯ抗原、外部コア及び内部コアで構成される多糖で形成されているリポ多糖（ＬＰＳ）である。ＬＰＳは、グラム陰性菌の外膜において見出され、動物において強力な免疫応答を引き出す。アネキシンＡ５は、負荷電を持つリン脂質を含有する生体膜への強力な結合を特徴とし、このため、内毒素に対して特に高い親和性を有する。このことは、内毒素産生宿主からのアネキシンＡ５の商業規模での大規模生産をより困難にしている。
【０００７】
現在のところ、（例えば、アネキシンＡ５タンパク質を、約１０００Ｌ以上の培養体積を有する組換え宿主細胞培養物から収集するために）商業規模の生産に合わせて規模拡大し、それに好都合に適用することができる効率的かつ費用効果のあるプロセスによって、治療グレードのアネキシンＡ５タンパク質を生産するようなプロセスは全く提供されておらず、内毒素汚染に対処するやり方でのプロセスはなおさらである。
【０００８】
１９９１年、Ｋｕｍａｒは、ＡｎｎｅｘｉｎＡ５の生産及び精製のためのプロセスの開発について報告した（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏｌｌｅｇｅｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｒｋａｎｓａｓ（Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ，ＡＲ）に提出された「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄＬａｒｇｅ－ＳｃａｌｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨｕｍａｎＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｎｎｅｘｉｎ－ＶＰｒｏｔｅｉｎ」と題されるＵｎｄｅｒｇｒａｄｕａｔｅＨｏｎｏｒｓＣｏｌｌｅｇｅＴｈｅｓｉｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｕａｒｋｉｖｅ．ｕａｒｋ．ｅｄｕ／ｘｍｌｕｉ／ｈａｎｄｌｅ／１０８２６／９８１にてオンラインで入手可能）。Ｋｕｍａｒのプロセスは、アネキシンＡ５を１００ｍＬ培養物フラスコ中で組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞において発現させ、細胞をペレット化し、ｐＨ７．２の５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ
２
からなるホモジナイゼーション／溶解緩衝液の存在下で細胞を再懸濁させ、次いで超音波処理を介して細胞を分解して、アネキシンＡ５タンパク質を放出させることを伴った。ＣａＣｌ
２
の添加により、カルシウム依存性様態で、細胞破片における細胞膜へのアネキシンＡ５の結合を引き起こし、次いで混合物は、２０分間の第１の精製遠心分離工程に供され、その後、上清が破棄され、細胞破片を含有するペレット及び結合したアネキシンＡ５が回収された。アネキシンＡ５は、ＥＤＴＡを使用してペレットから放出され、これに続いて、２０分間の第２の精製遠心分離工程及び上清中のアネキシンＡ５の収集が行われた。次いで、この後に一晩の透析を行って、アネキシンＡ５用の緩衝液をｐＨ８．０のトリスＨＣｌに変更してから、ＤＥＡＥ－セファロースカラムでの陰イオン交換、及び塩勾配を用いたアネキシンＡ５の溶出のさらなる工程が行われた。
【０００９】
本出願者は、Ｋｕｍａｒの方法に多数の制限及び欠点があることに気づいた。第１に、それは、１００ｍＬ培養物を使用して小規模で実証されるにすぎず、精製プロセス中に２つの別個の遠心分離工程を必要とする。これは、高体積培養物（例えば、１０００Ｌ以上）を使用する商業プロセスには効率的なやり方で規模拡大できない。下記でさらに考察されるように、かかる高体積の流体の遠心分離は、極めて時間を浪費し、費用がかかる。それでも、遠心分離は、細胞破片における膜へのアネキシンＡ５のカルシウム誘導性結合を用いることに依存するＫｕｍａｒの手法において、予備的捕捉工程として必要とされる。第２に、本出願者は、Ｋｕｍａｒの方法が、例えば、第１の精製遠心分離工程の生成物の上清中の結合していない可溶性アネキシンを処分することによって、アネキシンＡ５タンパク質の高損失につながることに気づいた。第３に、Ｋｕｍａｒの方法は、治療的使用に好適なレベルまで内毒素を除去することが全くできず、最終生成物中の内毒素レベルに関して検査が何ら行われないことは注目に値する。かくして、Ｋｕｍａｒの方法は、効率的かつ時間効果のある様態で商業的生産に規模拡大することは不可能であり、アネキシンＡ５タンパク質の高損失（すなわち低収率）につながり、治療的使用に好適でない低グレードのタンパク質精製をもたらす。
【００１０】
２００８年、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ、ＴａｉｔＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙは、「ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｎｎｅｘｉｎＶｆｒｏｍｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ１２ａ－ＰＡＰＩ」と題される文献を公開した。それは、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅｐｔｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｌａｂｗｅｂ／Ｆａｃｕｌｔｙ／Ｔａｉｔ／１０８．ｐｄｆにてオンラインで入手可能である。記載された方法は、Ｋｕｍａｒによって提案された手法と非常に類似している。この方法は、１Ｌ培養物中で組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞においてアネキシンＡ５を発現させ、細胞をペレット化し、ｐＨ７．２の５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ
２
からなるホモジナイゼーション／溶解緩衝液の存在下で細胞を再懸濁させ、次いで超音波処理を介して細胞を分解して、アネキシンＡ５タンパク質を放出させる。ＣａＣｌ
２
の添加により、カルシウム依存性様態で、細胞破片における細胞膜へのアネキシンＡ５の結合を引き起こし、次いで混合物は、２０分間の第１の精製遠心分離工程に供され、その後、上清が破棄され、細胞破片を含有するペレット及び結合したアネキシンＡ５が回収された。アネキシンＡ５は、ＥＤＴＡを使用してペレットから放出され、続いて、２０分間の第２の精製遠心分離工程及び上清中のアネキシンＡ５の収集が行われた。次いで、この後に透析工程を行って、アネキシンＡ５用の緩衝液をｐＨ８．０のトリスＨＣｌに変更してから、ＭｏｎｏＱカラムでの陰イオン交換、及び塩勾配を用いたアネキシンＡ５の溶出のさらなる工程が行われた。本出願者は、Ｋｕｍａｒの方法における多数の制限及び欠点がこの方法にも当てはまることに気づいた。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許