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公開番号2025046038
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-02
出願番号2023154185
出願日2023-09-21
発明の名称サル痘ウイルス及び水痘・帯状疱疹ウイルス検出用オリゴヌクレオチド及びその用途
出願人東洋紡株式会社,国立大学法人筑波大学
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12Q 1/6876 20180101AFI20250326BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】サル痘ウイルス及び/又は水痘・帯状疱疹ウイルスを検出する有用な手法等を提供すること。
【解決手段】(A)特定の塩基配列を含む、少なくとも15塩基の塩基配列A1、又は塩基配列A1において1～3個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列A2を有し、かつ(B)5’末端又は3’末端のいずれか一方のみが標識されている、サル痘ウイルス検出用プローブ、並びに該プローブを用いて、試料中に含まれ得るサル痘ウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルスを1反応中で同時に検出する方法が提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する、サル痘ウイルス検出用プローブ：
（Ａ）配列番号１の６５～１００番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列Ａ１、又は塩基配列Ａ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ａ２を有する。
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記（Ａ）の塩基配列の長さが１５～２０塩基である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記（Ａ）の塩基配列が、配列番号２～７のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記（Ｂ）の標識が蛍光色素標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記（Ｂ）の標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
前記（Ｂ）の標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項７】
前記（Ｂ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項８】
前記（Ｂ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項９】
前記（Ｂ）において、標識されている末端塩基がシトシンである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１０】
以下の特徴（Ｃ）及び（Ｄ）を有する、水痘・帯状疱疹ウイルス検出用プローブ：
（Ｃ）配列番号８の９５～１２５番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１４塩基の塩基配列Ｃ１、又は塩基配列Ｃ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｃ２を有する。
（Ｄ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれ得るサル痘ウイルス（Monkeypox virus：MPV）及び水痘・帯状疱疹ウイルス（varicella zoster virus：VZV）を検出するためのオリゴヌクレオチド等に関する。更に、本発明は、該オリゴヌクレオチドを用いて、試料中に含まれ得るサル痘ウイルス及び水痘・帯状疱疹ウイルスを検出（特に1反応中で同時に検出）する方法及びその方法に用いるための試薬及びキット等に関する。
続きを表示（約 5,100 文字）【背景技術】
【０００２】
サル痘ウイルスは、感染した人や動物の皮膚の病変、体液、又は血液との接触（性的接触を含む）等により感染する。２０２２年の欧米を中心とした流行では、５万２千人以上の感染例が報告されており、死亡例も報告されておりサル痘ウイルスの検査についても迅速な対応が必要とされている。また、日本国内での感染も認められており今後の流行状況についても注視していく必要がある。
【０００３】
さらに、サル痘ウイルスと臨床症状が酷似しているウイルスとして水痘・帯状疱疹ウイルスが挙げられる。日本国内でも、サル痘ウイルス感染者が発生したことを受け、国立感染症研究所よりサル痘ウイルスに関する病原体検出マニュアルが２０２２年６月に公開されている。国立感染症研究所より公開されたサル痘ウイルスに関する病原体検出マニュアルではサル痘ウイルスと水痘・帯状疱疹ウイルスとの同時検出を目的としたダブル標識核酸プローブ（Ｔａｑｍａｎプローブ、加水分解プローブ等とも呼ばれる）を用いたリアルタイムＰＣＲ法も公開されている。（非特許文献１）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
国立感染症研究所, 病原体検出マニュアルサル痘ウイルス, 第１版, ２０２２年６月公開
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に記載のリアルタイムＰＣＲ法では、定量的な検出も可能であるが、ＰＣＲのサイクル毎に測光する必要があるため、最も短い場合でも検出に約１時間を要する。
【０００６】
核酸増幅産物を検出する方法として、融解曲線解析法が知られている。融解曲線解析法は、核酸増幅と検出を別工程で実施することができ、最短３０分間程度で比較的簡便に測定が可能である。さらに蛍光標識核酸プローブを用いた融解曲線解析は、自動分析装置を利用した遺伝子検査にも適合させ易いという利点がある。しかし未だ、融解曲線解析法で高感度にサル痘ウイルス及び水痘・帯状疱疹ウイルスを１反応中で同時に検出可能な核酸プローブは知られていない。
【０００７】
本発明の１つの目的は、試料中に含まれ得るサル痘ウイルス及び／又は水痘・帯状疱疹ウイルスを検出する有用な手法等を提供できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究を行った結果、特定の核酸プローブを用いることで、簡便でありながら、高感度にサル痘ウイルス及び水痘・帯状疱疹ウイルスを検出（特に１反応中で同時に検出）する方法を見出した。斯かる知見を基に更に検討を重ねることにより、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は、以下の態様を包含する。
［項１］以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する、サル痘ウイルス検出用プローブ：
（Ａ）配列番号１の６５～１００番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列Ａ１、又は塩基配列Ａ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ａ２を有する。
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項２］前記（Ａ）の塩基配列の長さが１５～２０塩基である、項１に記載のプローブ。
［項３］前記（Ａ）の塩基配列が、配列番号２～７のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列を含む、項１又は２に記載のプローブ。
［項４］前記（Ｂ）の標識が蛍光色素標識である、項１～３のいずれかに記載のプローブ。
［項５］前記（Ｂ）の標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、項１～４のいずれかに記載のプローブ。
［項６］前記（Ｂ）の標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、項１～５のいずれかに記載のプローブ。
［項７］前記（Ｂ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～６のいずれかに記載のプローブ。
［項８］前記（Ｂ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～７のいずれかに記載のプローブ。
［項９］前記（Ｂ）において、標識されている末端塩基がシトシンである、項１～８のいずれかに記載のプローブ。
［項１０］以下の特徴（Ｃ）及び（Ｄ）を有する、水痘・帯状疱疹ウイルス検出用プローブ：
（Ｃ）配列番号８の９５～１２５番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１４塩基の塩基配列Ｃ１、又は塩基配列Ｃ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｃ２を有する。
（Ｄ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項１１］前記（Ｃ）の塩基配列の長さが１４～２０塩基である、項１０に記載のプローブ。
［項１２］前記（Ｃ）の塩基配列が、配列番号９～１３のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列を含む、項１０又は１１に記載のプローブ。
［項１３］前記（Ｄ）の標識が蛍光色素標識である、項１０～１２のいずれかに記載のプローブ。
［項１４］前記（Ｄ）の標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、項１０～１３のいずれかに記載のプローブ。
［項１５］前記（Ｄ）の標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、項１０～１４のいずれかに記載のプローブ。
［項１６］前記（Ｄ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１０～１５のいずれかに記載のプローブ。
［項１７］前記（Ｄ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１０～１６のいずれかに記載のプローブ。
［項１８］前記（Ｄ）において、標識されている末端塩基がシトシンである、項１０～１７のいずれかに記載のプローブ。
［項１９］項１～９のいずれかに記載のプローブ及び項１０～１８のいずれかに記載のプローブを用いて、試料中に含まれ得るサル痘ウイルス及び水痘・帯状疱疹ウイルスを１反応中で同時に検出する方法。
［項２０］以下の工程（１）、（２）、及び（３）：
（１）サル痘ウイルス及び水痘・帯状疱疹ウイルスを含み得る試料を提供する工程、
（２）工程（１）で提供された試料を含有する反応液において核酸増幅反応を行う工程、及び
（３）工程（２）の核酸増幅反応で得られた１又は複数の核酸増幅産物を、項１～９のいずれかに記載の１又は複数のプローブ及び項１０～１８のいずれかに記載の１又は複数のプローブを用いて検出する工程、
を含む、項１９に記載の方法。
［項２１］前記工程（２）がＰＣＲ反応により実施され、前記ＰＣＲ反応に用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである、項２０に記載の方法。
［項２２］前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、項２１に記載の方法。
［項２３］前記工程（２）の核酸増幅反応で使用するサル痘ウイルス検出用プライマーセットが、配列番号１の１～７０番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１８塩基の塩基配列Ｓ１又は前記塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を有する第一のプライマーと、配列番号１の９５～１５０番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも２０塩基の塩基配列Ｓ３又は前記塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を有する第二のプライマーとを含み、第二のプライマーが第一のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的である、項２０～２２のいずれかに記載の方法。
［項２４］前記第一のプライマーが、配列番号１４～１７のいずれかで示される塩基配列、その相補的な塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列を有し、かつ、前記第二のプライマーが、配列番号１８～２０のいずれかで示される塩基配列、その相補的な塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列を有する、項２３に記載の方法。
［項２５］前記工程（２）の核酸増幅反応で使用する水痘・帯状疱疹ウイルス検出用プライマーセットが、配列番号８の１～１００番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１９塩基の塩基配列Ｓ５又は前記塩基配列Ｓ５において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ６を有する第一のプライマーと、配列番号８の１２０～１７５番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１８塩基の塩基配列Ｓ７又は前記塩基配列Ｓ７において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ８を有する第二のプライマーとを含むプライマーセットであって、第二のプライマーが第一のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的である、項２０～２４のいずれかに記載の方法。
［項２６］前記第一のプライマーが、配列番号２１～２３のいずれかで示される塩基配列、その相補的な塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列を有し、かつ、前記第二のプライマーが、配列番号２４～２６のいずれかで示される塩基配列、その相補的な塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列を有する、項２５に記載の方法。
［項２７］前記工程（３）の検出する工程が、融解曲線分析により実施される、項２０～２６のいずれかに記載の方法。
［項２８］項１～９のいずれかに記載のプローブ及び項１０～１８のいずれかに記載のプローブを含む、サル痘ウイルス及び水痘・帯状疱疹ウイルスを１反応中で同時に検出するためのキット。
［項２９］項２３又は２４に記載のプライマーセット及び項２５又は２６に記載のプライマーセットを含む、サル痘ウイルス及び水痘・帯状疱疹ウイルスを１反応中で同時に検出するためのキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、試料中に含まれ得るサル痘ウイルス及び水痘・帯状疱疹ウイルスを検出する有用な手法等を提供できる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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