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公開番号2024151260
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-24
出願番号2023064507
出願日2023-04-11
発明の名称抗SARS-CoV-2抗体
出願人花王株式会社,株式会社Epsilon Molecular Engineering
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C07K 16/10 20060101AFI20241017BHJP(有機化学)
要約【課題】SARS-CoV-2のヌクレオカプシドタンパク質(Nタンパク質)に結合する抗体を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するCDR1～3を含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体であって、たとえばVHH等の単一ドメイン抗体、構造ドメインの1又は複数と該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの1又は複数を連結した多量体等である抗体、及び該抗体をコードする核酸を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）から選択されるＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＲＴＦＳＤＹＤＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＳＧＧＳＴＫ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＨＤＹＦＹＶＤＮＷＥＳＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＲＹＤＭＳ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＤＷＬＱＷＤＷＡＹ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＱＨＨＱＥＬＱＨＷＹＡＷＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＱＤＨＮＳＶＬＡＤＡＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＳＧＤＳＴＨ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＥＩＤＧＬＥＥＮＤＹ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＧ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＱＮＫＥＨＶＧＫＲＩＥＤＹ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
続きを表示（約 330 文字）【請求項２】
Ｎ－タンパク質に結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
単一ドメイン抗体又はその多量体である、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
単一ドメイン抗体がＶＨＨである、請求項３記載の抗体。
【請求項５】
単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【請求項６】
単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【請求項７】
請求項１～６のいずれか１項記載の抗体をコードする核酸。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質に結合する抗体に関する。
続きを表示（約 3,000 文字）【背景技術】
【０００２】
ＳＡＲＳコロナウイルス－２（Ｓｅｖｅｒｅａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ２，；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）やＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と同様ベータコロナウイルス属に属し、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となるＳＡＲＳ関連コロナウイルスである。２０１９年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認され、その後、ＣＯＶＩＤ－１９の世界的流行（パンデミック）を引き起こしている。
【０００３】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度で、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。また、ウイルス粒子（ビリオン）は、５０～２００ｎｍほどの大きさである。一般的なコロナウイルスと同様に、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質として知られる４つのタンパク質と、ＲＮＡより構成されている。このうちヌクレオカプシドタンパク質がＲＮＡと結合してヌクレオカプシドを形成し、脂質と結合したスパイクタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質がその周りを取り囲んでエンベロープを形成する（非特許文献１、２）。
【０００４】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質（以下、Ｎタンパク質）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノムに結合するタンパク質である。ウイルスゲノムのフォールディング・ウイルスタンパク質のアセンブリ・ウイルスの出芽といったウイルス粒子形成に関与するほか、宿主細胞の応答を抑制する機能があることが報告されている（非特許文献３）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、そのウイルスを構成するタンパク質の中で最も数の多いタンパク質の一つであることが報告されており（非特許文献４）、Ｎタンパク質の数は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面に露出しているスパイクタンパク質よりも遥かに多いため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原検査では、特に検出感度の点において、標的分子として好ましいタンパク質である。
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、感染細胞内で主に発現するタンパク質の一つであり、強い免疫原性を示す。２００２年１１月より流行したＳＡＲＳ－ＣｏＶのＮタンパク質に対するＥＬＩＳＡ法では、高い特異性で感染初期と見られる患者も診断できたことが報告されている（非特許文献５）。
【０００５】
そして、近年のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされる新型コロナウイルス感染症の世界的流行を受けて、イムノクロマト法を原理とした抗原検査の如く、ＰＯＣＴ（ＰｏｉｎｔｏｆＣａｒｅＴｅｓｔｉｎｇ：簡易迅速検査）の必要性が以前にも増して高まっている。イムノクロマト法では、予め用意された金コロイドやラテックス粒子等と結合した抗体（以下、標識抗体と呼ぶ）と被検体中に含まれる抗原が複合体を形成しながら毛細管現象によりニトロセルロース膜上を移動し、予めニトロセルロース膜上に固相化された抗体（以下、捕捉抗体と呼ぶ）が抗原－標識抗体複合体と結合することで呈色することを利用した免疫測定法である。現在、市販されているイムノクロマトキットの殆どはマウスやウサギ等に由来するモノクローナル、又はポリクローナルＩｇＧ抗体が用いられている。
【０００６】
一方、ラクダ科動物の血清中から見いだされた重鎖抗体は、通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）が重鎖と軽鎖の２つの可変領域で抗原と結合するのに対し、１つの可変領域のみで結合活性と抗原特異性を示す。この抗体の可変領域はＶＨＨ(ＶａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｏｆＨｅａｖｙｃｈａｉｎｏｆＨｅａｖｙｃｈａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ) と呼ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量（通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）の１０分の１程度）とされる（非特許文献６）。
ＶＨＨはＩｇＧ抗体と同等の結合活性を示しながらも、（１）ＩｇＧ抗体と比較して分子量が１０分の１程度であり、従来の抗体では結合できない新規のエピトープが期待されること、（２）ＩｇＧ抗体とは異なり、可逆性の高いタンパク質構造をもち、熱や圧に対して優れた耐性を示すこと、（３）ＩｇＧ抗体とは異なり、酵母や細菌等の微生物を用いた生産が可能であること、等の特徴をもつ。さらに、（４）ＶＨＨは、ｃＤＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法等の試験管内の抗体選抜技術との親和性が非常に高く、マウスやウサギ等への免疫によって得られるＩｇＧ抗体と比較して、より短期間に開発することが可能である。
【０００７】
また、検査薬の開発においても、ＶＨＨの優位性は明らかである。特に、ＶＨＨが有する特性から、（１）ＶＨＨは粒子やニトロセルロース膜に高密度に固相化することが可能であり、より多くのパラトープを基材上に提示することができること、（２）ＶＨＨはタンパク質としての安定性に優れており、製品のより優れた保存安定性が期待できること、（３）ＶＨＨは微生物によって大量かつ安価に生産可能であるため、製造原価をより低減させることが出来ること、（４）ＶＨＨはイムノクロマト法において非特異的反応の原因となりうるＦｃ領域を有さないこと、がＩｇＧ抗体と比較して優位であると考えられる。
【０００８】
しかしながら、イムノクロマト法等の抗原検査法にＶＨＨを用いることには課題がある。可変領域のみからなるＶＨＨは、（１）ＩｇＧ抗体と比較して低分子量であるため、基材への物理的な吸着性能が低いこと、（２）基材への固相化時に受けるタンパク質変性効果により、結合活性が低下しやすいこと、（３）ＩｇＧ抗体とは異なり、ＶＨＨはＦｃ領域を持たないため、基材へのランダムな吸着において配向性の制御が困難であること、が知られている。このような理由から、ＶＨＨを捕捉抗体として用いた場合、結合活性が低下しやすいことが課題となる。すなわち、イムノクロマト法において、ＶＨＨを捕捉抗体として用いた場合、高感度に抗原を検出することが難しいことが知られている。
【０００９】
この課題に対して、非特許文献７ではコンジュゲーションパッドに標識抗体としてのＶＨＨ及びビオチン標識化されたＶＨＨの２種類の抗体を含ませておき、そしてニトロセルロース膜上にはビオチンに対して結合活性を示すストレプトアビジンを固相化する方法が用いられている。すなわち、ニトロセルロース膜上で、標識抗体―抗原―ビオチン化ＶＨＨの複合体を形成させ、その複合体をストレプトアビジンにより捕捉する方法である（従来技術１）。
【００１０】
また、非特許文献８では標識抗体にＶＨＨを用いており、捕捉抗体としては予め用意されたビオチン化ＶＨＨ―ストレプトアビジン複合体をニトロセルロース膜上に固相化する方法が用いられている。すなわち、ニトロセルロース膜におけるＶＨＨの固相化をストレプトアビジンとニトロセルロース膜間の相互作用に依存させる方法である（従来技術２）。
（【００１１】以降は省略されています）

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