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公開番号2024119178
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-03
出願番号2023025897
出願日2023-02-22
発明の名称魚類の生殖腺発育促進剤
出願人国立大学法人東京大学
代理人弁理士法人フィールズ国際特許事務所
主分類A61K 38/22 20060101AFI20240827BHJP(医学または獣医学;衛生学)
要約【課題】新規な魚類の生殖腺発育促進剤の提供。
【解決手段】本発明によれば、コレシストキニン受容体作動剤(CCK受容体作動剤)を有効成分として含んでなる、魚類の生殖腺発育促進剤が提供される。本発明によればまた、CCK受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の卵胞刺激ホルモン放出促進剤が提供される。本発明によればまた、CCK受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法が提供される。本発明によればまた、CCK受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、生殖腺の発育が促進された魚類の生産方法が提供される。本発明によればまた、CCK受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、早期催熟された魚類の生産方法が提供される。
【選択図】図3

特許請求の範囲【請求項１】
コレシストキニン（ＣＣＫ）受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の生殖腺発育促進剤。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
生殖腺が卵巣である、請求項１に記載の促進剤。
【請求項３】
卵胞細胞および／または卵母細胞の発育を促進するための、請求項１または２に記載の促進剤。
【請求項４】
ＣＣＫ受容体作動剤がＣＣＫまたはガストリンである、請求項１に記載の促進剤。
【請求項５】
ＣＣＫまたはガストリンが、ヒトまたは魚類のＣＣＫまたはガストリンである、請求項４に記載の促進剤。
【請求項６】
ＣＣＫおよびガストリンが、式（Ａ）ＤＸ
１
Ｘ
２
ＧＷＸ
３
ＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｘ
１
はＹまたはＡであり、前記Ｙは硫酸化されていてもよく、Ｘ
２
およびＸ
３
は任意のアミノ酸である）（配列番号１３）のアミノ酸配列または式（Ｂ）ＷＸ
４
ＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｘ
４
は任意のアミノ酸である）（配列番号１２）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチドである、請求項４に記載の促進剤。
【請求項７】
前記式（Ａ）のアミノ酸配列が、
式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６）、
式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）、
式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５）、
式（４）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１８）、
式（５）ＤＹＶＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１９）、
式（６）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号２０）および
式（７）ＤＡＮＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（配列番号２１）
からなる群から選択される、請求項６に記載の促進剤。
【請求項８】
魚類が、下位条鰭類または真骨魚類である、請求項１または５に記載の促進剤。
【請求項９】
ＣＣＫ受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤。
【請求項１０】
ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の生殖腺発育促進剤に関する。本発明はまた、魚類の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤に関する。
続きを表示（約 4,400 文字）【背景技術】
【０００２】
脊椎動物において、卵を成長させて排卵させる制御システムとして、脳下垂体で産生される卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）といった生殖腺刺激ホルモン（ＧＴＨ）が中心的役割を果たしている。魚類では、脳下垂体から分泌されたＦＳＨが血流に入り卵母細胞を取り囲む卵胞細胞に作用し、エストロジェンおよびビテロジェニンを介することにより、卵母細胞では卵黄形成が進み、卵母細胞が発育する。人工飼育環境下のウナギ等においては、生殖腺の成熟がほとんど進行しないため人為的な成熟誘導（人為催熟）が行われる。近年の人為催熟の研究により、ウナギやその他の魚類の発達中の卵巣において卵母細胞と、卵母細胞を取り囲む卵胞細胞の発育はＦＳＨのみによって促進され、ＬＨは卵母細胞の最終成熟・排卵の誘発のみに関わることが明らかとなってきた（非特許文献１および２）。人為催熟としては、これまでウナギの卵を得るためにＦＳＨの投与が行われてきたものの、ＦＳＨは複雑な糖タンパク質ホルモンであり、合成に莫大なコストがかかる。このため、ＦＳＨの比較的安価な代用として、サケ脳下垂体抽出物を使用する技術が用いられているが、排卵を促すホルモン等の夾雑物の影響による卵質の低下が課題となっている。
【０００３】
魚類において、ＬＨの制御には視床下部ホルモンであるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ／ＬＨＲＨ）が有効であることが古くから知られていた。一方で、卵胞細胞および卵母細胞の発達を促すＦＳＨの制御に関しては明らかとなっていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Takahashi et al., Endocrinology, 157, 2016: 3994-4002.
日本水産学会誌、８６（５）、３６４－３６６（２０２０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、魚類の生殖腺発育促進剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは今般、イン・サイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法および免疫組織化学により、メダカ成体脳下垂体においてＦＳＨ細胞がＣＣＫ受容体Ｂ１（ＣＣＫＲＢ１）を発現し、視床下部のＣＣＫニューロンからの支配を受けることを見出した。本発明者らはまた、ＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイにより、メダカＣＣＫ－８およびメダカガストリン－８がＣＣＫＲＢ１を介してｃＡＭＰ、Ｃａ
２＋
およびＭＡＰＫを賦活することを見出した。本発明者らはまた、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトメダカの解析により、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトメダカでは卵巣および精巣の発達が著しく阻害され、ＦＳＨ発現量も著しく低下することを見出した。本発明者らはまた、カルシウムイメージング解析により、メダカＣＣＫ－８およびメダカＣＣＫ－４がＦＳＨ細胞の細胞内カルシウム濃度を急激に上昇させること、すなわちＦＳＨ放出を促進することを見出した。本発明者らはまた、ＰＣＲ法および二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法により、メダカで見出した知見が魚類一般において保存された機構であって、魚類一般に適用できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【０００７】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］コレシストキニン（ＣＣＫ）受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の生殖腺発育促進剤。
［２］生殖腺が卵巣である、上記［１］に記載の促進剤。
［３］卵胞細胞および／または卵母細胞の発育を促進するための、上記［１］または［２］に記載の促進剤。
［４］ＣＣＫ受容体作動剤がＣＣＫまたはガストリンである、上記［１］～［３］のいずれかに記載の促進剤。
［５］ＣＣＫまたはガストリンが、ヒトまたは魚類のＣＣＫまたはガストリンである、上記［４］に記載の促進剤。
［６］ＣＣＫおよびガストリンが、式（Ａ）ＤＸ
１
Ｘ
２
ＧＷＸ
３
ＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｘ
１
はＹまたはＡであり、前記Ｙは硫酸化されていてもよく、好ましくは硫酸化チロシンであり、Ｘ
２
およびＸ
３
は任意のアミノ酸であり、Ｘ
２
は好ましくはＭ、Ｖ、Ｎ、Ａ、Ｑ、Ｒ、ＴまたはＮであり、Ｘ
３
は好ましくはＶ、ＬまたはＭである）（配列番号１３）のアミノ酸配列または式（Ｂ）ＷＸ
４
ＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｘ
４
は任意のアミノ酸であり、Ｘ
４
は好ましくはＭ、ＬまたはＶである）（配列番号１２）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチドである、上記［４］または［５］に記載の促進剤。
［７］前記式（Ａ）のアミノ酸配列が、
式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６）、
式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）、
式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５）、
式（４）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１８）、
式（５）ＤＹＶＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１９）、
式（６）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号２０）および
式（７）ＤＡＮＧＷＭＤＦ－ＮＨ
２
（配列番号２１）
からなる群から選択される、上記［６］に記載の促進剤。
［８］魚類が、下位条鰭類または真骨魚類である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の促進剤。
［９］ＣＣＫ受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤。
［１０］ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法。
［１１］ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、生殖腺の発育が促進された魚類の生産方法。
［１２］魚類がウナギまたはチョウザメである、上記［１１］に記載の方法。
［１３］上記［１１］または［１２］に記載の方法を実施して生殖腺の発育が促進された魚類を生産し、次いで、生殖腺の発育が促進された魚類から卵を採取する、魚類の卵の採取方法。
［１４］上記［１３］に記載の方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させることを含む、魚類の受精卵の生産方法。
［１５］上記［１３］に記載の方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させ、さらに得られた受精卵を孵化させることを含む、魚類の仔魚の生産方法。
［１６］生殖腺の発育が促進された魚類が、早期催熟された魚類である、上記［１１］～［１５］のいずれかに記載の生産方法。
【０００８】
本発明によれば、魚類において生殖腺、特に卵胞細胞および卵母細胞の発育を、４ないし８アミノ酸からなる非常に安価なＣＣＫおよびガストリン等のＣＣＫ受容体作動剤の投与により促進できる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、メダカ成体脳下垂体におけるＦＳＨｂプローブおよびＣＣＫＲＢ１プローブを用いた二重イン・サイチュハイブリダイゼーションの結果を示す図である。左はＦＳＨｂの像（マゼンタ）、中央はＣＣＫＲＢ１の像（緑色）、右はＦＳＨｂとＣＣＫＲＢ１とを重ね合わせた像である。脳下垂体においてＦＳＨｂとＣＣＫＲＢ１との発現の重なりが観察された。
図２は、メダカ成体脳におけるＣＣＫ抗体を用いた免疫組織化学の結果を示す図である。左は視床下部、右は脳下垂体の像である。図中の矢印は、ＣＣＫニューロンの細胞体を示す。
図３は、ＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイの結果を示す図である。ＡはｃＡＭＰ、ＢはＣａ
２＋
、ＣはＭＡＰＫに対応するレポーターのＣＣＫおよびガストリンにより賦活された活性を示す。
図４は、ＣＣＫＲＢ１ノックアウト個体における生殖腺の表現型および脳下垂体におけるＦＳＨ遺伝子の発現量を示す図である。Ａは野生型およびＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体の卵巣および精巣の表現型、ＢはＣＣＫＲＢ１ヘテロノックアウト個体およびＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体におけるＦＳＨｂｍＲＮＡの定量結果（ＦＳＨｂ／ａｃｔｂ）を示す。
図５は、ＣＣＫペプチドに対するＦＳＨ細胞の反応性および用量応答性に関するカルシウムイメージング解析の結果を示す図である。Ａは式（２）のペプチドへの反応性、Ｂは式（８）のペプチドへの反応性、Ｃは式（２）のペプチドへの用量応答性を示す。なお、ＡおよびＢのグラフの縦軸は細胞内カルシウム（Ｃａ
２＋
）レベルの相対値を示し、横軸はペプチド投与後の経過時間（秒）を示す。Ｃのグラフの縦軸は細胞内カルシウムレベルの相対値を示す。
図６は、ウナギおよびチョウザメの脳下垂体におけるＣＣＫＲＢ遺伝子の発現を示す図である。左のレーンより、１００ｂｐラダーマーカー、ウナギＣＣＫＲＢ、チョウザメＣＣＫＲＢのＰＣＲ産物の電気泳動を示す。
図７は、ウナギ脳下垂体におけるＦＳＨｂプローブおよびＣＣＫＲＢプローブを用いた二重イン・サイチュハイブリダイゼーションの結果を示す図である。左はＦＳＨｂの像（マゼンタ）、中央はＣＣＫＲＢの像（緑色）、右はＣＣＫＲＢとＦＳＨｂとを重ね合わせた像である。脳下垂体においてＦＳＨｂとＣＣＫＲＢとの発現の重なりが観察された。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明において「コレシストキニン受容体作動剤」（本明細書において、「ＣＣＫ受容体作動剤」ともいう）は、ＣＣＫ受容体介在性シグナル伝達を活性化する薬剤をいう。
（【００１１】以降は省略されています）

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