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公開番号2024052354
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-11
出願番号2022159018
出願日2022-09-30
発明の名称超高分子ガンマ-ポリグルタミン酸、該ポリグルタミン酸を産生するバチルス属細菌変異株及び該バチルス属細菌変異株のスクリーニング方法
出願人国立大学法人神戸大学
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12N 15/01 20060101AFI20240404BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】平均分子量2000万以上の超高分子ガンマ-ポリグルタミン酸を提供する。該超高分子γ-PGAを産生可能なバチルス属細菌変異株を提供する。該超高分子γ-PGAを産生可能なバチルス属細菌変異株のスクリーニング方法等を提供する。
【解決手段】バチルス属細菌変異株を作製し、平均分子量2000万以上のガンマ-ポリグルタミン酸を産生させる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
平均分子量２０００万以上のガンマ－ポリグルタミン酸。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
次の工程（Ｉ）～（ＩＩＩ）を含む、平均分子量２０００万以上のガンマ－ポリグルタミン酸を産生するバチルス属細菌変異株のスクリーニング方法：
（Ｉ）次の工程（Ｉ－１）又は（１－２）
（Ｉ－１）PgsBCA及びPgdSを発現可能なバチルス属細菌を培地で培養する工程、
（Ｉ－２）バチルス属細菌とポリヌクレオチドとを混合し、培地で培養する工程、
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）で培養して得た培養物を平板培地に接種し、コロニーを形成させる工程、
（ＩＩＩ）前記工程（ＩＩ）で形成させたコロニーから光沢を有するコロニーを選択する工程、
ここで、工程（Ｉ－２）において、
バチルス属細菌とポリヌクレオチドの少なくとも一方が、バチルス属細菌由来pgsA断片をコードする塩基配列を有し、
バチルス属細菌とポリヌクレオチドの少なくとも一方が、バチルス属細菌由来pgsB断片をコードする塩基配列を有し、
バチルス属細菌とポリヌクレオチドの少なくとも一方が、バチルス属細菌由来pgsC断片をコードする塩基配列を有し、且つ、
バチルス属細菌とポリヌクレオチドの少なくとも一方が、バチルス属細菌由来PgdS断片をコードする塩基配列を有する、及び／又は、工程（ＩＩ）においてバチルス属細菌由来PgdSタンパク質存在下でコロニーを形成させる。
【請求項３】
更に、前記工程（ＩＩＩ）で選択したコロニーを培養し、培養物中のガンマ－ポリグルタミン酸の平均分子量を決定する工程を含む、
請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
バチルス属細菌が枯草菌である、請求項２又は３に記載するスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項２又は３に記載するスクリーニング方法により得られたバチルス属細菌変異株を培養する工程を含む、平均分子量２０００万以上のガンマ－ポリグルタミン酸の製造方法。
【請求項６】
平均分子量２０００万以上のガンマ－ポリグルタミン酸を産生するバチルス属細菌変異株。
【請求項７】
バチルス属細菌変異株が、以下の（Ａ）及び（Ｂ）を備える枯草菌変異株である、請求項６に記載のバチルス属細菌変異株：
（Ａ）PgsBCAを発現する、
（Ｂ）PgsAが次の（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなる、
（Ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目から５６番目までのアミノ酸配列、
（Ｂ２）前記（Ｂ１）に記載する１番目から５６番目までのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（Ｂ３）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目から３６８番目までのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（Ｂ４）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目から３８０番目までのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
超高分子ガンマ－ポリグルタミン酸、該ポリグルタミン酸を産生するバチルス属細菌変異株及び該バチルス属細菌変異株のスクリーニング方法等に関する。
続きを表示（約 3,300 文字）【背景技術】
【０００２】
納豆菌をはじめとする一部のバチルス属（Bacillus）細菌は、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ）を産生できることが知られている。γ－ＰＧＡは、Ｌ体とＤ体のγ－グルタミン酸からなるγ－ＬＤ－ポリグルタミン酸（γ－ＬＤ－ＰＧＡ）である。バチルス属細菌がγ－ＰＧＡ生産する目的のひとつとして高塩条件等の外部ストレスへの適応が挙げられる。γ－ＰＧＡは粘性を有しており、細胞の周囲に粘性のあるγ－ＰＧＡを排出することで、外部ストレスから細胞を保護しているといわれている。代表的なバチルス属細菌の一種である枯草菌（Bacillus subtilis）は、グラム陽性菌のモデル微生物として知られており、その安全性と遺伝子操作の簡便性から研究が進んでいる。
【０００３】
このようなバチルス属細菌では、ＰｇｓＢ、ＰｇｓＣ、ＰｇｓＡ及びＰｇｓＥの４つのタンパク質から構成されるγ－ＰＧＡ合成酵素複合体ＰｇｓＢＣＡＥによってγ－ＰＧＡが産生されることが知られている。しかし、γ－ＰＧＡ産生には、これらのうちＰｇｓＥは必須ではなく、ＰｇｓＢＣＡの発現で十分であることが確認されている。一方、ＰｇｓＢＣＡのうちＰｇｓＡの必要性については矛盾した報告が散見され、例えば、γ－ＰＧＡ生産には、ＰｇｓＢ、ＰｇｓＣ及びＰｇｓＡの全てが必須であるとの報告ある一方で、ＰｇｓＡは必須ではないという報告もある。ＰｇｓＡは必須ではないという報告の例として、特許文献１には、プラスミドを用いてＰｇｓＢＣのみを発現する組換え微生物を作製したところ、γ－ＰＧＡが生産されたことが報告されている。
【０００４】
特許文献２には、平均分子量５００万以上の超高分子γ－ＰＧＡが得られたこと、特に平均分子量１５００万の超高分子γ－ＰＧＡも得られたことが報告されているが、一般的には、γ－ＰＧＡの平均分子量は数万～５００万程度であるとの報告が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特開２００９－８９７０８号公報
【０００６】
特開２００８－２０２０４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
平均分子量２０００万以上の超高分子ガンマ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ）を提供することを目的とする。また、平均分子量２０００万以上の超高分子γ－ＰＧＡを産生可能なバチルス属細菌変異株を提供することを目的とする。また、平均分子量２０００万以上の超高分子γ－ＰＧＡを産生可能なバチルス属細菌変異株のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、かねてよりバチルス属細菌やγ－ＰＧＡについて鋭意検討を重ねていたところ、γ－ＰＧＡを生産するバチルス属細菌において、Ｄ体グルタミン酸とＬ体グルタミン酸、あるいは、Ｌ体グルタミン酸とＬ体グルタミン酸との間の結合を切断する機能を持つ分解酵素ＰｇｄＳを過剰発現させると、γ－ＬＤ－ＰＧＡが分解されるためにコロニーは光沢を失うものの、光沢を失わないコロニーが出現することを見出した。また、このように出現したコロニーについて更に調べたところ、ＰｇｄＳの欠失によりコロニーが出現したと思われる株もみられたが、それ以外に、ＰｇｄＳが欠失していないにもかかわらずコロニーを形成可能であると思われる株が認められ、これらは全てγ－Ｌ－ＰＧＡを生産可能であり且つＰｇｓＡをコードするアミノ酸配列又は塩基配列に変異を持つ変異株であることを見出した。本発明は該知見に基づき更に検討を重ねて完成されたものであり、本開示は例えば下記に代表される発明を包含する。
項１．平均分子量２０００万以上のガンマ－ポリグルタミン酸。
項２．次の工程（Ｉ）～（ＩＩＩ）を含む、平均分子量２０００万以上のガンマ－ポリグルタミン酸を産生するバチルス属細菌変異株のスクリーニング方法：
（Ｉ）次の工程（Ｉ－１）又は（１－２）
（Ｉ－１）PgsBCA及びPgdSを発現可能なバチルス属細菌を培地で培養する工程、
（Ｉ－２）バチルス属細菌とポリヌクレオチドとを混合し、培地で培養する工程、
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）で培養して得た培養物を平板培地に接種し、コロニーを形成させる工程、
（ＩＩＩ）前記工程（ＩＩ）で形成させたコロニーから光沢を有するコロニーを選択する工程、
ここで、工程（Ｉ－２）において、
バチルス属細菌とポリヌクレオチドの少なくとも一方が、バチルス属細菌由来pgsA断片をコードする塩基配列を有し、
バチルス属細菌とポリヌクレオチドの少なくとも一方が、バチルス属細菌由来pgsB断片をコードする塩基配列を有し、
バチルス属細菌とポリヌクレオチドの少なくとも一方が、バチルス属細菌由来pgsC断片をコードする塩基配列を有し、且つ、
バチルス属細菌とポリヌクレオチドの少なくとも一方が、バチルス属細菌由来PgdS断片をコードする塩基配列を有する、及び／又は、工程（ＩＩ）においてバチルス属細菌由来PgdSタンパク質存在下でコロニーを形成させる。
項３．更に、前記工程（ＩＩＩ）で選択したコロニーを培養し、培養物中のガンマ－ポリグルタミン酸の平均分子量を決定する工程を含む、
項２に記載のスクリーニング方法。
項４. バチルス属細菌が枯草菌である、項２又は３に記載するスクリーニング方法。
項５．項２～４のいずれか一項に記載するスクリーニング方法により得られたバチルス属細菌変異株を培養する工程を含む、平均分子量２０００万以上のガンマ－ポリグルタミン酸の製造方法。
項６．平均分子量２０００万以上のガンマ－ポリグルタミン酸を産生するバチルス属細菌変異株。
項７．バチルス属細菌変異株が、以下の（Ａ）及び（Ｂ）を備える枯草菌変異株である、項６に記載のバチルス属細菌変異株：
（Ａ）PgsBCAを発現する、
（Ｂ）PgsAが次の（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなる、
（Ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目から５６番目までのアミノ酸配列、
（Ｂ２）前記（Ｂ１）に記載する１番目から５６番目までのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（Ｂ３）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目から３６８番目までのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（Ｂ４）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目から３８０番目までのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
【発明の効果】
【０００９】
平均分子量２０００万以上の超高分子γ－ＰＧＡ及びその製造方法を提供することができる。平均分子量２０００万以上の超高分子γ－ＰＧＡを産生するバチルス属細菌変異株のスクリーニング方法を提供することができる。平均分子量２０００万以上の超高分子γ－ＰＧＡを産生するバチルス属細菌変異株を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１は、配列番号１及び２を示す。
図２は、配列番号３及び４を示す。
図３は、配列番号５及び６を示す。
図４は、配列番号７及び８を示す。
図５は、試験例１の株の構築手順を示す。
図６は、試験例１の株の構築手順を示す。
図７は、試験例１で作製した変異株が産生するγ－ＰＧＡの平均分子量を示す。
図８は、試験例２のＤＮＡ断片の構築手順を示す。
図９は、試験例２で得た変異株を示す。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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