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公開番号2025113272
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-01
出願番号2025076285,2023189998
出願日2025-05-01,2019-05-16
発明の名称オフターゲット効果が低下した修飾RNA剤
出願人アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 15/113 20100101AFI20250725BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明が解決しようとする課題は、オフターゲット遺伝子サイレンシング効果を低減しつつ、標的遺伝子発現の阻害にとって有利であるdsRNA分子にとって有効なヌクレオチド又は化学的モチーフ及び治療用途に適したRNAi組成物を提供することである。
【解決手段】本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖RNA(dsRNA)分子であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、14～40のヌクレオチドを有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、RNA干渉を媒介するために前記標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、5’領域の最初の9つのヌクレオチド位置内における二本鎖の少なくとも1つの熱不安定化修飾又はその前駆体を含み、ここで、前記センス鎖は、ASGPRリガンドを含み、ここで、前記不安定化修飾は、修飾アンロック核酸(mUNA)及びグリコール核酸(GNA)から選択される、二本鎖RNA(dsRNA)分子に関する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～４０のヌクレオチドを有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために前記標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内における二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾又はその前駆体を含み、ここで、前記センス鎖は、ＡＳＧＰＲリガンドを含み、ここで、前記不安定化修飾は、修飾アンロック核酸（ｍＵＮＡ）及びグリコール核酸（ＧＮＡ）から選択される、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子。
続きを表示（約 3,700 文字）【請求項２】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
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2025113272000139.jpg
87
170
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ－（ＣＨ
２
）
２
ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ
２
；ＮＨ
２
；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ－ｎＰｒ；Ｏ－アルキル；Ｏ－アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５－Ｍｅ－Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２－チオウリジン；４－チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６－ジアミノプリン；シュードシトシン；２－アミノプリン；キサントシン；Ｎ６－アルキル－Ａ；Ｏ６－アルキル－Ｇ；２－チオウリジン；４－チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７－デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
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2025113272000140.jpg
53
170
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ－（ＣＨ
２
）
２
ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ
２
；ＮＨ
２
；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ－ｎＰｒ；Ｏ－アルキル；Ｏ－アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５－Ｍｅ－Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２－チオウリジン；４－チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６－ジアミノプリン；シュードシトシン；２－アミノプリン；キサントシン；Ｎ６－アルキル－Ａ；Ｏ６－アルキル－Ｇ；２－チオウリジン；４－チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７－デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
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2025113272000141.jpg
85
170
（Ｒ＝Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ－（ＣＨ
２
）
２
ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ
２
；ＮＨ
２
；Ｍｅ；Ｏ－ｎＰｒ；Ｏ－アルキル；Ｏ－アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５－Ｍｅ－Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２－チオウリジン；４－チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６－ジアミノプリン；シュードシトシン；２－アミノプリン；キサントシン；Ｎ６－アルキル－Ａ；Ｏ６－アルキル－Ｇ；７－デアザプリンであり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
JPEG
2025113272000142.jpg
85
170
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ－（ＣＨ
２
）
２
ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ
２
；ＮＨ
２
；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ－ｎＰｒ；Ｏ－アルキル；Ｏ－アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５－Ｍｅ－Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２－チオウリジン；４－チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６－ジアミノプリン；シュードシトシン；２－アミノプリン；キサントシン；Ｎ６－アルキル－Ａ；Ｏ６－アルキル－Ｇ；２－チオウリジン；４－チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７－デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
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2025113272000143.jpg
52
170
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ－（ＣＨ
２
）
２
ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ
２
；ＮＨ
２
；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ－ｎＰｒ；Ｏ－アルキル；Ｏ－アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５－Ｍｅ－Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２－チオウリジン；４－チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６－ジアミノプリン；シュードシトシン；２－アミノプリン；キサントシン；Ｎ６－アルキル－Ａ；Ｏ６－アルキル－Ｇ；２－チオウリジン；４－チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７－デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
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2025113272000144.jpg
83
170
（Ｒ＝Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ－（ＣＨ
２
）
２
ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ
２
；ＮＨ
２
；Ｍｅ；Ｏ－ｎＰｒ；Ｏ－アルキル；Ｏ－アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５－Ｍｅ－Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２－チオウリジン；４－チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６－ジアミノプリン；シュードシトシン；２－アミノプリン；キサントシン；Ｎ６－アルキル－Ａ；Ｏ６－アルキル－Ｇ；７－デアザプリンであり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
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2025113272000145.jpg
156
170
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2025113272000146.jpg
205
170
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2025113272000147.jpg
94
170
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記二本鎖の前記熱不安定化修飾は、
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2025113272000148.jpg
65
170
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、及び＊は、Ｒ、Ｓ又はラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１０】
少なくとも４つの２’－フルオロを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で２０１８年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６７２，４０５号明細書及び２０１８年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７１９，２９１号明細書の利益を主張し、それらの両方の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
続きを表示（約 2,600 文字）【０００２】
本発明は、望まれないオフターゲット効果を低減することによる標的遺伝子発現の阻害にとって有利である特定のモチーフを有するＲＮＡｉ二本鎖剤及び治療用途に適したＲＮＡｉ組成物に関する。加えて、本発明は、例えば、様々な疾患の治療のために、これらのＲＮＡｉ二本鎖剤を投与することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉又は「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を遮断し得るという観察を記述するため、Ｆｉｒｅ及び同僚らによって最初に造られた用語である（非特許文献１；非特許文献２）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能を試験するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、そのサイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼのＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介される。ＲＩＳＣは、その二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短いＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を有することが知られるが、この活性のタンパク質成分は、未知のままであった。
【０００４】
ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果の１つがｍｉＲＮＡ様効果であり、ここで、ＲＮＡ干渉におけるコアエフェクターであるアルゴノートタンパク質が、ＲＮＡ干渉を誘導するために人工的に導入されるｓｉＲＮＡをｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）として処理する（非特許文献３）。ｍｉＲＮＡは、遺伝子抑制のため、シード領域（５’末端から２～９位）と標的ｍＲＮＡとの間の塩基対合を通して標的遺伝子の多くを認識する。ｓｉＲＮＡによって引き起こされるオフターゲットは、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣ負荷アンチセンス鎖のシード領域と１つ以上のｍＲＮＡとの塩基相補性に起因する。ｓｉＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果は、幾つかの試験において報告されており、シード領域の配列に応じて多数の遺伝子の発現に影響し、ｓｉＲＮＡに基づく表現型スクリーニングにおいて最大３０％の陽性ヒットの原因になるほど重大である。加えて、ｍｉＲＮＡの場合、シード領域と標的との間の相互作用が弱くなるとき、それらの３’末端領域内での相補的対合（３’相補的対合）を通して標的遺伝子をサイレンシングすることも報告されており、それは、ｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果がかかる機構によって媒介される可能性が高いことを意味する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Ｆｉｒｅｅｔａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１，８０６－８１１
Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．（２００１）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１５，１８８－２００
Ｌａｍｅｔａｌ．（２０１５）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（２０１５）４，ｅ２５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ｓｉＲＮＡ遺伝子療法の遺伝子サイレンシングの有効性を損なうことなく、化学修飾の合理的な適用によってｓｉＲＮＡの設計を調節することにより、ｓｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果を除去又は低減するような努力が続けられている。本発明は、その効果を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、オフターゲット遺伝子サイレンシング効果を低減しつつ、標的遺伝子発現の阻害にとって有利であるｄｓＲＮＡ分子にとって有効なヌクレオチド又は化学的モチーフ及び治療用途に適したＲＮＡｉ組成物を提供する。
【０００８】
本発明者らは、特に、ｄｓＲＮＡ分子が、アンチセンス鎖がシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２～９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、及びｄｓＲＮＡ分子が約４０℃～約８０℃の範囲内の融解温度を有する場合、ＲＮＡ干渉を媒介するのに、不安定化修飾を欠いている親ｄｓＲＮＡ分子よりも有効であり得ることを発見している。一部の実施形態では、不安定化修飾は、本明細書の実施例１～３に記載されている修飾アンロック核酸（ｍＵＮＡ）及びグリコール核酸（ＧＮＡ）構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ－ｉｓｏＣ、ＧＮＡ－ｉｓｏＧ、５’－ｍＵＮＡ、４’－ｍＵＮＡ、３’－ｍＵＮＡ、２’－ｍＵＮＡからなる群から選択され、その構造は、以下の通りである：
JPEG
2025113272000001.jpg
75
170
（式中、塩基は、修飾又は非修飾核酸塩基であり、及び各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓ又はラセミのいずれかを表す）。
【０００９】
本明細書に開示されている様々な態様の一部の実施形態では、不安定化修飾は、２’－５’ＲＮＡ、すなわちＭｏｄ８である。一部の好ましい実施形態では、不安定化修飾が２’－５’ＲＮＡである場合、不安定化修飾は、アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）７位に存在する。
【００１０】
本明細書に開示されている様々な態様の一部の実施形態では、５’－ｍＵＮＡは、５’－（Ｓ）－Ｍｅ－ＵＮＡ（Ｙ９５）又は５’－（Ｒ）－Ｍｅ－ＵＮＡ（Ｙ９７）であり、その構造は、図３２に示されている。本明細書に開示されている様々な態様の一部の実施形態では、２’－ｍＵＮＡは、２’－（Ｓ）－Ｍｅ－ＵＮＡ（Ｙ９６）又は２’－（Ｒ）－Ｍｅ－ＵＮＡ（Ｙ９８）であり、その構造は、図３２に示されている。本明細書に開示されている様々な態様の一部の実施形態では、３’－ｍＵＮＡは、３’－（Ｓ）－Ｍｅ－ＵＮＡ（Ｙ９９）、３’－（Ｒ）－Ｍｅ－ＵＮＡ（Ｙ１００）又は３’－（Ｒ）－Ｍｅ－４’－（Ｓ）－ヒドロキシメチル－ＵＮＡ（Ｙ１０２）であり、その構造は、図３２に示されている。本明細書に開示される様々な態様の一部の実施形態では、４’－（β）－ＯＭｅ－ＵＮＡ（Ｙ１０１）であり、その構造は、図３２に示されている。
（【００１１】以降は省略されています）

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