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公開番号2025102869
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-08
出願番号2025055723,2022539170
出願日2025-03-28,2020-12-30
発明の名称AAVカプシドタンパク質を分析する方法
出願人サレプタセラピューティクス, インコーポレイテッド
代理人個人,個人
主分類G01N 30/88 20060101AFI20250701BHJP(測定;試験)
要約【課題】液体クロマトグラフィー、質量分析、および/または紫外線(UV)可視分光法を用いて、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中のVP1、VP2、およびVPSカプシドタンパク質を特徴解析する方法を提供すること。
【解決手段】本方法は概して、(a)AAV粒子を液体クロマトグラフィーに供して変性し、次いで、VP1、VP2、およびVPSカプシドタンパク質を分離すること、および(b)工程(a)で産生された分離VP1、VP2、およびVPSカプシドタンパク質をUVおよび質量分析に供して、AAV粒子中のVP1、VP2、およびVPSカプシドタンパク質の比および質量を決定する工程を含む。別の態様では、本開示は、翻訳後修飾を含むAAV組成物を提供する。本開示はまた、液体クロマトグラフィー質量分析を用いて、AAV組成物の純度を特性解析する方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
本明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月３日出願の米国仮特許出願第６２／９５６，６８１号、２０２０年９月１日出願の米国仮特許出願第６３／０７３，１８８号、および２０２０年１２月１日出願の米国仮特許出願第６３／１１９，９０９号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の優先権を主張するものであり、これらのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 2,100 文字）【０００２】
本開示は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を用いてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびにＡＡＶ組成物の純度を特性解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は急速に、遺伝子治療を送達するための最も広く用いられる媒体の一つとなりつつある。広範な標的組織の形質導入の効率性の高さとともに優れた安全性プロファイルにより、ＡＡＶは、遺伝子治療に最も広く使用されるプラットフォームとされてきた。ＡＡＶは、パルボウイルス科に属する小さなウイルスである。ウイルスは、約４．７キロベースの線状の一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する、非エンベロープ型の二十面体カプシドからなる。ＡＡＶは一般的に、適切な宿主細胞で組換えにより発現される。しかし、組換えＡＡＶは、宿主細胞溶解物由来のタンパク質によって汚染されることがある。
【０００４】
ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質の混合物を含むが、これらのタンパク質は、選択的スプライシングおよび翻訳によって単一のウイルスＣａｐ遺伝子から産生され、自己組織化してカプシドを形成する。ＡＡＶカプシドタンパク質は、ウイルスの感染性、組織指向性、および効力に重要な役割を果たし、カプシドタンパク質の質量および比を完全に特性解析する能力は、遺伝子治療用のＡＡＶの商業製造のためにますます重要となりつつある。
【０００５】
具体的には、ＶＰの化学量論が、ウイルスベクターの感染性に極めて重要である。例えば、ＶＰ１／ＶＰ２比のバランスがとれていなかった場合であっても、高レベルのＶＰ３カプシドは、形質導入効率の不良および効力の低下と負の関係があった。（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、ｖｏｌｕｍｅ２５、ｐａｇｅｓ４１５－４２４（２０１８））。製造で得た構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の比は、広い範囲、例えば１：１：５から１：１：２０で変動し得ることから（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＡｄｖ．，２６（１）：７３－８８（２００８））、三つのカプシドタンパク質間の比の正確な測定は、ＡＡＶベクターの品質管理において重要である。しかし、現在の方法では、カプシドタンパク質の質量の測定を試みたものの、各ＶＰの化学量論を決定することができなかった（ＷＯ２０１８／０３５０５９）。そのため、ＡＡＶカプシドタンパク質の比および修飾と、ｒＡＡＶ組成物の純度とをより正確に特性解析するための堅牢な方法が、遺伝子治療業界で求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を用いて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を特性解析する方法を提供する。本明細書に開示される方法は、ＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比、ならびに／またはＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち一つまたは複数の質量を決定するために使用される。
【０００７】
一部の態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比を決定する方法を提供する。本方法は、ＡＡＶ粒子を約７０℃から約９０℃で液体クロマトグラフィーに供するステップを含み、ここでは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の質量および比は、質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって決定される。一部の態様では、カプシドタンパク質の個々の質量は、質量分析によって測定される。一部の態様では、ＡＡＶ粒子上のカプシドは、液体クロマトグラフィーのカラム内でＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質のそれぞれに変性される。一部の態様では、カプシドタンパク質は、液体クロマトグラフィーによって分離される。
【０００８】
一部の態様では、本方法は、質量分析を用いて、ＡＡＶ粒子中のＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち一つまたは複数の質量を決定することをさらに含む。
【０００９】
一部の態様では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の相対量は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の紫外線（ＵＶ）クロマトグラムを分析することによって決定される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは逆相液体クロマトグラフィーである。一部の態様では、ＡＡＶ粒子はＡＡＶｒｈ７４である。
【００１０】
一部の態様では、クロマトグラフィーは、水中にトリフルオロ酢酸を含む第一の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリルと水との混合物中にトリフルオロ酢酸を含む第二の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーにおいて、第一の移動相と第二の移動相との組合せにおける第二の移動相のパーセンテージは、経時的に増加する。
（【００１１】以降は省略されています）

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