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公開番号2025087535
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-10
出願番号2023202268
出願日2023-11-29
発明の名称組換え微生物、組換えタンパク質およびC6化合物の製造方法
出願人旭化成株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 1/21 20060101AFI20250603BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】C6化合物を生産することのできる組換え微生物、組換えタンパク質および製造方法を提供すること。
【解決手段】ムコン酸を還元して2-ヘキセン二酸に変換する活性、および、2-ヘキセン二酸を還元してアジピン酸に変換する活性の少なくとも1つの還元活性を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を含む組換え微生物であって、前記外来性遺伝子が、特定のアミノ酸配列を有する、または、特定のポリヌクレオチド配列からなる、組換え微生物。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
還元活性を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を含む組換え微生物であって、
前記還元活性が、ムコン酸を還元して２－ヘキセン二酸に変換する活性、および、２－ヘキセン二酸を還元してアジピン酸に変換する活性の少なくとも１つであり、
前記外来性遺伝子が、以下：
（ｉ）配列番号２８、２９または３０に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号２８、２９または３０に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号５８、５９または６０に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号５８、５９または６０に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｖ）配列番号５８、５９または６０に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、または
（ｖｉ）配列番号５８、５９または６０に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
である、組換え微生物。
続きを表示（約 1,900 文字）【請求項２】
前記外来性遺伝子が、以下：
（ｖｉｉ）配列番号２８、２９または３０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または、
（ｖｉｉｉ）配列番号５８、５９または６０に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
である、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記外来性遺伝子が、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｋａｇｉｉおよびＴｒｅｐｏｎｅｍａｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｍから選択される少なくとも１つに由来する、請求項１または２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記組換え微生物が、Ｃ６化合物の生産経路を有し、
前記Ｃ６化合物が、アジピン酸および２－ヘキセン二酸からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１または２に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記組換え微生物が、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、アルカリハロバチルス（Ａｌｋａｌｉｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する、請求項１または２に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記組換え微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である、請求項１または２に記載の組換え微生物。
【請求項７】
２－エノエートレダクターゼをコードする遺伝子、２，４－ジエノイルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、ＦＡＤ依存性オキシドレダクターゼをコードする遺伝子、およびＮＡＤＨ－フラビンオキシドレダクターゼ／ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１または２に記載の組換え微生物。
【請求項８】
請求項１または２に記載の組換え微生物を用いるＣ６化合物の製造方法であって、
前記Ｃ６化合物が、アジピン酸および２－ヘキセン二酸からなる群から選択される少なくとも一つである、製造方法。
【請求項９】
（ａ）ムコン酸を還元して２ーヘキセン二酸に変換する活性、および、２－ヘキセン二酸を還元してアジピン酸に変換する活性の少なくとも１つである還元活性を有し、
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号２８、２９または３０に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号２８、２９または３０に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号５８、５９または６０に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｉｖ）配列番号５８、５９または６０に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｖ）配列番号５８、５９または６０に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるか、または
（ｖｉ）配列番号５８、５９、または６０に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる、組換えタンパク質。
【請求項１０】
（ｖｉｉ）配列番号２８、２９または３０に示すアミノ酸配列からなるか、または、
（ｖｉｉｉ）配列番号５８、５９または６０に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、請求項９に記載の組換えタンパク質。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え微生物、組換えタンパク質およびＣ６化合物の製造方法に関する。本発明は特に、２－ヘキセン二酸およびアジピン酸の少なくとも１つを生産することのできる組換え微生物、組換えタンパク質および製造方法に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
アジピン酸、コハク酸、フマル酸、イタコン酸、およびグルタル酸といったモノおよびジカルボン酸は化学産業において重要な化合物であり、例えば、アジピン酸（ＣＡＳＮｏ．１２４－０４－９）は、ナイロン－６６などに代表される合成繊維、プラチック、ウレタン、および可塑剤原料など多様な製品の原料となるモノマー化合物である。
【０００３】
アジピン酸は現在、一般的には、石油由来のベンゼンから誘導されるシクロヘキサノール単独の硝酸酸化、または、シクロヘキサノールとシクロヘキサノンとの混合物の硝酸酸化により製造されるが、その過程で亜酸化窒素（Ｎ
２
Ｏ）などの有毒な副産物が生成する。あるいは、従来の石油化学的経路よりも環境に優しい経路として、ムコン酸を化学的水素化により還元してアジピン酸を製造することもできる。
【０００４】
しかしながら、これらの化学プロセスはエネルギー多消費であり、かつ、地球温暖化の一因とされている。そのため、化石燃料由来の原料から、バイオマス由来原料をはじめとする再生可能な資源原料への移行は低炭素社会実現に向けた重要な方策である。
【０００５】
生物は様々な生合成経路および代謝経路を有しており、中でも微生物には特定の遺伝子操作を行うことができることが知られている。そのため、遺伝子組換えにより代謝改変された微生物を使用した発酵生産は、持続可能な製造方法として注目されている。
【０００６】
例えば、アジピン酸、６－アミノカプロン酸、またはカプロラクタム生合成のための微生物が報告されている（特許文献１）。当該微生物による方法では、クエン酸回路により生合成されるスクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡを３－オキソアジピル－ＣｏＡに変換する「スクシニル－ＣｏＡ：アセチル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ」、３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡに変換する「３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを５－カルボキシ―２－ペンテノイル－ＣｏＡに変換する「３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡデヒドラターゼ」、５－カルボキシ―２－ペンテノイル－ＣｏＡをアジピル－ＣｏＡに変換する「５－カルボキシ－２－ペンテノイル－ＣｏＡレダクターゼ」、ならびに、アジピル－ＣｏＡをアジペートに変換する「ホスホトランスアジピラーゼ」および「アジピン酸キナーゼ」をコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いて、糖類からアジピン酸が製造される。
【０００７】
また、ムコン酸生合成のための微生物が報告されている（非特許文献１）。当該微生物による方法では、シキミ酸経路により合成される３－デヒドロシキミ酸をプロトカテク酸に変換する「３?デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ」、プロトカテク酸をカテコールに変換する「プロトカテク酸デカルボキシラーゼ」、ならびに、カテコールをｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸に変換する「カテコール１，２?ジオキシゲナーゼ」をコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いて、糖類からムコン酸が製造される。
【０００８】
さらに、エノエートレダクターゼを導入した微生物を用いることで、ムコン酸を２－ヘキセン二酸（２，３－デヒドロアジピン酸）を介してアジピン酸に変換し、ムコン酸を化学的水素化によって還元してアジピン酸を得るプロセスを発酵生産に置き換える方法も報告されている（特許文献２）。
【０００９】
これまでに報告された手法は、工業的利用に供するためには改善の余地があった。そのため、バイオマス由来の炭素原料からＣ６化合物を生合成する代替の手法への需要が存在した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
特許第５９５１９９０号明細書
国際公開第２０１７／００４７０９号
【非特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

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