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公開番号2025081588
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-27
出願番号2025026678,2023142905
出願日2025-02-21,2019-03-04
発明の名称組織からの目的の領域の隔離および発現分析のための方法、組成物、およびデバイス
出願人クァンタムサイト, インコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類G01N 1/28 20060101AFI20250520BHJP(測定;試験)
要約【課題】平らな組織切片中の少なくとも1つの目的の領域から細胞構成要素を単離する方法が、本明細書で提供される。
【解決手段】上記方法は、インサイチュであり、組織から領域を規定するために固定化したヌクレオチドアレイの下準備を要しない。上記方法は、組織切片上に疎水性マスクをインサイチュで準備して、目的の領域を隔離し、続いて、表面張力アレイを必要に応じて使用して、上記疎水性マスクによって境界線を描いた特定の目的の領域に、抽出および/または分析試薬を添加および/または除去することを包含し得る。
【選択図】図4
特許請求の範囲【請求項１】
図面に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年３月２日出願の米国仮出願第６２／６３７，９９８号、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ，ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ，ＡＮＤＤＥＶＩＣＥＳＦＯＲ
ＩＳＯＬＡＴＩＯＮＡＮＤＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＡＮＡＬＹＳＩＳＯＦＲＥＧＩＯＮＳＯＦＩＮＴＥＲＥＳＴＦＲＯＭＡＴＩＳＳＵＥＳＥＣＴＩＯＮ」および２０１８年６月２８日出願の米国仮出願第６２／６９１，５５９号、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ，ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ，ＡＮＤＤＥＶＩＣＥＳＦＯＲＩＳＯＬＡＴＩＯＮＡＮＤＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＡＮＡＬＹＳＩＳＯＦＲＥＧＩＯＮＳＯＦＩＮＴＥＲＥＳＴＦＲＯＭＡＴＩＳＳＵＥＳＥＣＴＩＯＮ」（これらの全体は、本明細書に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
続きを表示（約 10,000 文字）【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組織サンプルからの遺伝子およびタンパク質発現の従来の臨床分析は、核酸およびタンパク質を切片（例えば、組織の生検物）から抽出することを要する。選択機構が存在しないので、これらの切片に基づく分析は、組織内の種々の細胞タイプ（例えば、上皮、結合組織、および免疫）の発現プロフィールおよびＤＮＡ／ＲＮＡ配列データの複合を表す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要旨
いくつかの局面では、本開示は、配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、（ａ）固体基材上の前記平らな組織切片に、規定された目的の領域からポリマーで境界線を描いて、非物理的流体バリアを形成する工程であって、ここで前記目的の領域は、直径１ｍｍより小さい工程；および（ｂ）前記少なくとも１つの規定された目的の領域内の細胞をインサイチュで選択的に破壊する工程、を包含する方法を提供する。いくつかの局面では、本開示は、配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、前記平らな組織切片に、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く化学的マスクを付与する工程、を包含し、ここで前記化学的マスクは、前記少なくとも１つの目的の領域内の細胞の選択的破壊に適したバリアを形成し、前記化学的マスクは、物理的流体境界ではない、方法を提供する。いくつかの局面では、本開示は、配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記目的の領域内の細胞の破壊に適した溶媒を分与して、遊離した細胞構成要素を含む液滴を形成する工程、を包含し、ここで前記液滴は、前記目的の領域の外側の組織から、物理的バリアなしに流体連通から隔離される、方法を提供する。いくつかの局面では、本開示は、組織切片中の複数の目的の領域から生体分子を単離および検出する方法であって、前記方法は、疎水性マスクを組織切片に付与し、前記平らな組織切片中の少なくとも１０００個の目的の領域が、物理的バリアなしに互いとの流体連通から隔離される工程、および前記少なくとも１０００個の目的の領域内の細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出し、前記タンパク質または核酸の空間位置情報が保持される工程、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、直径約１００ミクロンより小さいかまたは直径約１００ミクロンに等しい目的の領域を隔離し得る。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、ＦＦＰＥ組織切片である。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出する工程を包含し、前記検出する工程は、前記細胞からインサイチュで遊離した前記核酸を配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記配列決定することは、前記インサイチュで遊離した核酸を、前記目的の領域の位置を識別するバーコードでタグ化することを包含する。いくつかの実施形態では、前記バーコードは、表面に連結されない。いくつかの実施形態では、前記タグ化することは、インサイチュで遊離したＲＮＡをタグ化することを包含し、（ａ）特有の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記少なくとも１０００個の目的の領域に付与すること；および（ｂ）第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を、前記少なくとも１０００個の目的の領域に対して行い、前記目的の領域は、互いから隔離されること、を包含する。本方法のいくつかの実施形態では、前記目的の領域から合成したｃＤＮＡ分子間で前記特有の核酸配列の相互汚染が低減される。いくつかの実施形態では、前記第１鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる。いくつかの実施形態では、前記第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる。いくつかの実施形態では、前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方を配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡを配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記ｍＲＮＡを配列決定することは、前記ｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡに対して行われる前増幅ステップを包含する。いくつかの実施形態では、前記前増幅ステップは、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムヘキサマープライマーでのＰＣＲ、ポリＡ特異的プライマーでのＰＣＲ、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ゲノムＤＮＡを配列決定することを包含する。いくつかの実施形態では、前記ゲノムＤＮＡを配列決定することは、前記ゲノムＤＮＡに対して行われる全ゲノム増幅（ＷＧＡ）ステップを包含する。いくつかの実施形態では、前記ＷＧＡ工程は、変性オリゴヌクレオチドプライム（ＤＯＰ）ＰＣＲ、マルチ置換増幅（ＭＤＡ）、マルチアニーリングおよびループ形成ベースの増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）、ＰｉｃｏＰｌｅｘ、自己縮重プライマーでの等温増幅、またはこれらの組み合わせである。
【０００４】
いくつかの局面では、本開示は、組織切片であって、前記切片に、物理的バリアなしに互いとの流体連通から隔離される、少なくとも１０００個の水性液滴を含む、組織切片を提供する。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、前記１０００個の水性液滴を、互いとの流体連通から隔離する疎水性マスクを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１０００個の水性液滴は、少なくとも１０００個の特有のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性マスクは、少なくともシアノアクリレートポリマーの層を含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性マスクは、少なくとも非シリル化フルオロアルキル層を含む。いくつかの実施形態では、前記非シリル化フルオロアルキル層は、フルオロアクリレートまたは非シリル化ペルフルオロアルカン化合物を含む。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、少なくともペルフルオロアルキルシラン層を含む。いくつかの実施形態では、前記ペルフルオロアルキルシラン層は、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランを含む。いくつかの実施形態では、前記ペルフルオロアルキルトリクロロシランは、ＦＯＴＳ（トリデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン）である。いくつかの実施形態では、前記ペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランは、PF10TAS(ペルフルオロデシルトリス(ジメチルアミノ)シラン)である。いくつかの実施
形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表面に連結されない。
【０００５】
いくつかの局面では、本開示は、固体基材上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離する方法であって、前記方法は、（ａ）前記平らな組織切片に、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く化学的マスクを付与する工程；および（ｂ）１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、前記目的の領域上に分与し、それによって、前記少なくとも１つの目的の領域内で境界線を描かれた細胞を選択的に溶解することによって、前記少なくとも１つの目的の領域内の細胞構成要素を溶解する工程、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記溶液を前記目的の領域上に分与する工程は、（ａ）前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、第２の固体基材の表面上に位置づけられた少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む薬剤移動デバイスに分与すること；（ｂ）前記第２の固体基材の表面上に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を、前記平らな組織切片に接触させ、前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、前記平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域に空間的に対応することであって、ここで前記接触させることは、前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を、前記平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域に移動させることを可能にし、それによって、前記少なくとも１つの目的の領域中の細胞構成要素を、前記１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液中で溶解させること、を包含する。いくつかの実施形態では、前記方法は、少なくとも１つの溶解させた細胞構成要素を、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域から単離する工程、をさらに包含する。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記少なくとも１つの目的の領域から溶解させた前記細胞構成要素の中で核酸を配列決定する工程、をさらに包含する。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記少なくとも１つの目的の領域から溶解させた前記細胞構成要素の中でタンパク質に対してタンデム質量分析を行う工程、をさらに包含する。いくつかの実施形態では、前記（ｂ）における溶液は、可溶性タグをさらに含み、ここで前記可溶性タグは、前記少なくとも１つの目的の領域に対応する。いくつかの実施形態では、前記可溶性タグは、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、前記目的の領域に対応するサンプルインデックス配列、および必要に応じて、特有の分子識別子配列を含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、前記目的の領域に対応する電荷タグを含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは２本鎖である。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ビーズに結合体化される。いくつかの実施形態では、前記可溶性タグは、タンデム質量タグである。いくつかの実施形態では、前記１種またはこれより多くの抽出薬剤は、１種またはこれより多くの界面活性剤、プロテアーゼ、張度調節剤、カオトロープ、ヌクレアーゼ、緩衝液、プロテアーゼインヒビター、ホスファターゼインヒビター、またはヌクレアーゼインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、前記化学的マスクは、接触角６０～１５５度を有する。いくつかの実施形態では、前記化学的マスクは、フルオロアルカンまたはフルオロアクリルポリマーを含む疎水性マスク溶液を介して付与される。いくつかの実施形態では、前記化学的マスク溶液は、アクリレートまたはシアノアクリレートを含む溶液を介して付与される。いくつかの実施形態では、前記化学的マスク溶液は、溶媒をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記溶媒は、ピロピレングリコール誘導体、フルオロカーボン、またはアルコールである。いくつかの実施形態では、前記溶媒は、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロ－２－メチルペンタン、ペルフルオロ－１，３－ジメチルシクロヘキサン、ペルフルオロデカリン、または１，３－ジフルオロプロパンである。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの目的の領域は、円形であり、前記目的の領域の直径は、１ｍｍもしくはこれ未満、５００ミクロンもしくはこれ未満、２５０ミクロンもしくはこれ未満、１２５ミクロンもしくはこれ未満、１００ミクロンもしくはこれ未満、８０ミクロンもしくはこれ未満、５０ミクロンもしくはこれ未満、２５ミクロンもしくはこれ未満、または１５ミクロンもしくはこれ未満である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの目的の領域は、面積約７．８×１０
５
平方ミクロン未満である。いくつかの実施形態では、前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、疎水性領域によって境界線が描かれた少なくとも１つの親水性領域を含む。いくつかの実施形態では、前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１０，０００ピコリットルもしくはこれ未満、１，０００ピコリットルもしくはこれ未満、５００ピコリットルもしくはこれ未満、２５０ピコリットルもしくはこれ未満、１００ピコリットルもしくはこれ未満、５０ピコリットルもしくはこれ未満、１０ピコリットルもしくはこれ未満、または２ピコリットルもしくはこれ未満の溶液体積を送達し得る。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの親水性領域の境界線を描く前記疎水性領域は、接触角６０～１５５度を有する。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記平らな組織切片中の１個より多くの目的の領域から細胞構成要素を溶解させることを包含する。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記平らな組織切片中の少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１０００個、または少なくとも１０，０００個の目的の領域からの細胞構成要素を溶解させることを包含する。いくつかの実施形態では、前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、グリッドパターンを含む。いくつかの実施形態では、前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、楕円を含む。いくつかの実施形態では、前記固体基材上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く前記疎水性マスクは、圧電式インクジェット送達デバイスを使用して前記平らな組織切片に付与される。いくつかの実施形態では、前記平らな組織切片は、約２～約５０μｍ厚である。いくつかの実施形態では、前記平らな組織切片は、約１～約１５μｍ厚である。いくつかの実施形態では、前記平らな組織切片は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片である。前記平らな組織切片は、固定されていない組織切片である。
【０００６】
いくつかの局面では、本開示は、第１の固体支持体上の平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離するためのシステムであって、前記システムは、（ａ）前記疎水性マスクで境界線が描かれる少なくとも１つの目的の領域を含む第１の固体支持体上の平らな組織切片；（ｂ）前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域と整列させるために、前記固体基材の表面に位置づけられた少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む第２の固体支持体であって、前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１種またはこれより多くの抽出薬剤を含む溶液を含む、第２の固体支持体；ならびに（ｃ）前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素を含む前記固体支持体に連結され、前記固体支持体を移し得、前記固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素が、疎水性マスクで境界線を描かれた平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域と接触し得る電動式ステージ、を含むシステムを提供する。いくつかの局面では、前記システムは、（ｉ）前記電動式ステージの位置を制御するように構成され、前記第２の固体基材上の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、前記組織切片中の少なくとも１つの目的の領域と接触するコンピューターシステム、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性マスク溶液は、（ｉ）疎水性マスク溶液を前記固体支持体上の組織切片に送達し得る圧電式インクジェット送達デバイス、および（ｉｉ）前記圧電式インクジェット送達デバイスを制御して、前記疎水性マスク溶液で前記平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域の境界線を描いて、疎水性マスクを生成するように構成されたコンピューターシステムによって付与される。いくつかの実施形態では、前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、疎水性領域によって境界線が描かれる少なくとも１つの親水性領域を含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性マスク溶液は、Ｃ７Ｆ１５ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、ＦＣ－７２２、ＰｅｒＦｌｕｏｒｏＣｏａｔ、またはＦｌｕｏｒｏＰｅｌのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性マスク溶液は、アクリレートまたはシアノアクリレートのうちの少なくとも一方を含む。いくつかの実施形態では、前記第２の固体基材の表面に位置づけられた前記少なくとも１つの薬剤移動アレイ要素は、１０，０００ピコリットルもしくはこれ未満、１，０００ピコリットルもしくはこれ未満、５００ピコリットルもしくはこれ未満、２５０ピコリットルもしくはこれ未満、１００ピコリットルもしくはこれ未満、５０ピコリットルもしくはこれ未満、１０ピコリットルもしくはこれ未満、または２ピコリットルもしくはこれ未満の溶液体積を送達し得る。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの親水性領域の境界線を描く疎水性領域の接触角は、６０～１５５度である。いくつかの実施形態では、疎水性マスク溶液付与のための前記システムは、前記平らな組織切片への付与後に前記疎水性マスク溶液を重合し得るＵＶ光源を含む。いくつかの実施形態では、疎水性マスク溶液付与のための前記システムは、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルシランの化学蒸着のための装置を含む。
【０００７】
いくつかの局面では、本開示は、平らな組織切片中の少なくとも１つの目的の領域から細胞構成要素を単離するためのキットであって、前記キットは、本明細書に記載される方法、システムまたは組織切片のいずれかの実施形態の局面のいずれか１つに記載の要素のうちのいずれかを含む、キットを提供する。
【０００８】
いくつかの局面では、本開示は、組織切片であって、最も下から最も上へと、前記組織切片に接して少なくとも１つのシアノアクリレート層、続いて、少なくとも１つのペルフルオロアルキルシラン層を含む、組織切片を提供する。いくつかの局面では、前記ペルフルオロアルキルシラン層は、ペルフルオロアルキルトリクロロシランまたはペルフルオロアルキルトリス（ジメチルアミノ）シランを含む。いくつかの実施形態では、前記ペルフルオロアルキルトリクロロシランは、ＦＯＴＳである。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、前記少なくとも１つのシアノアクリレート層の下に少なくとも１つの非シリル化フルオロアルキル層を含む。いくつかの実施形態では、前記非シリル化フルオロアルキル層は、フルオロアクリレートまたは非シリル化ペルフルオロアルカン化合物を含む。いくつかの実施形態では、前記ペルフルオロアルキルトリクロロシランは、ＦＯＴＳ（（トリデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン）である。いくつかの実施形態では、前記組織切片は、前記シアノアクリレート層を有する領域によって境界線が描かれる前記シアノアクリレート層を欠く少なくとも１つの領域を含む。いくつかの実施形態では、前記領域は、実質的に楕円形、多角形、または自由形態である。いくつかの実施形態では、前記組織切片への界面活性剤の水性溶液の付与は、前記領域内の細胞を溶解させ得る。いくつかの実施形態では、前記領域は、約１ｍｍ未満のサイズである。いくつかの実施形態では、前記領域は、約１００ミクロン未満のサイズである。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、
（ａ）固体基材上の前記平らな組織切片に、規定された目的の領域からポリマーで境界線を描いて、非物理的流体バリアを形成する工程であって、ここで前記目的の領域は、直径１ｍｍより小さい工程；および
（ｂ）前記少なくとも１つの規定された目的の領域内の細胞をインサイチュで選択的に破壊する工程、
を包含する方法。
（項目２）
配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、
前記平らな組織切片に、前記固体基材上の平らな組織切片中の前記少なくとも１つの目的の領域の境界線を描く化学的マスクを付与する工程、
を包含し、ここで前記化学的マスクは、前記少なくとも１つの目的の領域内の細胞の選択的破壊に適したバリアを形成し、前記化学的マスクは、物理的流体境界ではない、方法。（項目３）
配列決定または分析のために、固体基材上の平らな組織切片で少なくとも１つの目的の領域から生体分子を単離する方法であって、前記方法は、
前記固体基材上の平らな組織切片中の前記目的の領域内の細胞の破壊に適した溶媒を分与して、遊離した細胞構成要素を含む液滴を形成する工程、
を包含し、ここで前記液滴は、前記目的の領域の外側の組織から、物理的バリアなしに流体連通から隔離される、方法。
（項目４）
組織切片中の複数の目的の領域から生体分子を単離および検出する方法であって、前記方法は、
疎水性マスクを組織切片に付与し、前記平らな組織切片中の少なくとも１０００個の目的の領域が、物理的バリアなしに互いとの流体連通から隔離される工程、および
前記少なくとも１０００個の目的の領域内の細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出し、前記タンパク質または核酸の空間位置情報が保持される工程、
を包含する方法。
（項目５）
前記方法は、直径約１００ミクロンより小さいかまたは直径約１００ミクロンに等しい目的の領域を隔離し得る、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記組織切片は、ＦＦＰＥ組織切片である、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。（項目７）
前記目的の領域内の細胞からインサイチュで遊離した複数のタンパク質または核酸を検出する工程を包含し、ここで前記検出する工程は、前記細胞からインサイチュで遊離した前記核酸を配列決定することを包含する、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記配列決定することは、前記インサイチュで遊離した核酸を、前記目的の領域の位置を識別するバーコードでタグ化することを包含する、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記バーコードは、表面に連結されない、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記タグ化することは、インサイチュで遊離したＲＮＡをタグ化することを包含し、
（ａ）特有の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記少なくとも１０００個の目的の領域に付与すること；および
（ｂ）第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を、前記少なくとも１０００個の目的の領域に対して行い、前記目的の領域は、互いから隔離されること、
を包含する、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記目的の領域から合成したｃＤＮＡ分子間で前記特有の核酸配列の相互汚染が低減される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第１鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成は、インサイチュで行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方を配列決定することを包含する、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ｍＲＮＡを配列決定することを包含する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ｍＲＮＡを配列決定することは、前記ｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡに対して行われる前増幅ステップを包含する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記前増幅ステップは、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムヘキサマープライマーでのＰＣＲ、ポリＡ特異的プライマーでのＰＣＲ、またはこれらの任意の組み合わせである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞からインサイチュで遊離した核酸を配列決定することは、ゲノムＤＮＡを配列決定することを包含する、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
【０００９】
援用の表示
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個々に参考として援用されていることが示されるものと同程度まで、参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の新規な特徴は、添付の請求項において詳細に記載される。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面への言及によって得られる。
（【００１１】以降は省略されています）

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