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公開番号2024134940
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-04
出願番号2023045404
出願日2023-03-22
発明の名称タンパク質の機能に影響を与える機能性物質の探索方法
出願人国立大学法人信州大学
代理人個人,個人,個人
主分類G01N 33/50 20060101AFI20240927BHJP(測定;試験)
要約【課題】細胞内のタンパク質の揺らぎ構造を十分に反映している三次元構造を用いて、当該タンパク質の機能に影響を与える機能性物質を探索する方法を提供すること。
【解決手段】タンパク質の機能に影響を与える機能性物質を探索する、機能性物質の探索方法であって:リボソーム上で翻訳と並進してフォールディングされたタンパク質と、機能性物質候補と、を接触させるステップAと;前記機能性物質候補による、前記タンパク質の機能への影響を判定するステップBと;を具備する探索方法を提供する。ここで、前記翻訳と並進してフォールディングされたタンパク質は、前記リボソーム表面と相互作用している。
【選択図】図9
特許請求の範囲【請求項１】
タンパク質の機能に影響を与える機能性物質を探索する、機能性物質の探索方法であって：
リボソーム上で翻訳と並進してフォールディングされたタンパク質と、機能性物質候補と、を接触させるステップAと；
前記機能性物質候補による、前記タンパク質の機能への影響を判定するステップBと；
を具備し、
前記翻訳と並進してフォールディングされたタンパク質は、前記リボソーム表面と相互作用している、探索方法。
続きを表示（約 850 文字）【請求項２】
前記ステップAにおいて、前記翻訳と並進してフォールディングされたタンパク質は、無細胞タンパク質合成系で合成される、請求項１に記載の探索方法。
【請求項３】
前記ステップAは、前記タンパク質をコードする塩基配列Xと前記塩基配列Xに直接またはリンカーとなるペプチド鎖をコードする塩基配列Ｚを介して連結したアレスト塩基配列Yとを含むRNAを、リボソームに翻訳させることを含む、請求項１又は２に記載の探索方法。
【請求項４】
前記タンパク質をコードする塩基配列Xと、前記アレスト塩基配列Yとは、リンカーとなるペプチド鎖をコードする塩基配列Zを介して連結している、請求項３に記載の探索方法。
【請求項５】
前記リンカーとなるペプチド鎖は柔軟性を有する、請求項４に記載の探索方法。
【請求項６】
前記アレスト塩基配列Yは、SecMペプチド配列又はその誘導体をコードするか、uORF2 ペプチド配列をコードするか、またはステムループを形成するRNA配列である、請求項１又は２に記載の探索方法。
【請求項７】
前記タンパク質は、前記機能性物質のための結合部位を有する、請求項１又は２に記載の探索方法。
【請求項８】
前記タンパク質は酵素であり、
前記ステップAにおいて、前記リボソーム上で翻訳と並進してフォールディングされたタンパク質と、前記機能性物質候補と、前記酵素の基質と、を接触させる、請求項１又は２に記載の探索方法。
【請求項９】
前記タンパク質は、リン酸化酵素、タンパク質分解酵素、発光タンパク質、その他の機能性タンパク質である、請求項１又は２に記載の探索方法。
【請求項１０】
前記機能性物質候補は、低分子、中分子、高分子、ペプチド、抗体、又は核酸アプタマーである、請求項１又は２に記載の探索方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の機能に影響を与える機能性物質を探索する方法に関する。
続きを表示（約 3,300 文字）【背景技術】
【０００２】
医薬品などの有用化合物は、疾患発症に関連するタンパク質に結合して、その機能を阻害又は促進することがある。そのため、有用化合物の探索では、特定のタンパク質との選択的結合性や、その機能への影響を評価することが行われる。
【０００３】
タンパク質は、RNA (mRNA)からリボソームによって翻訳されたポリペプチド鎖が立体的にフォールディングされ、安定な天然状態をとる。安定な天然状態にあるタンパク質に結合する化合物も、タンパク質の機能に影響を与えうる。さらに、安定な天然状態にあるタンパク質に結合しない化合物であっても、タンパク質の機能に影響を与えることがある。これは、細胞内のタンパク質は、必ずしも安定な天然状態にある構造のみをとるわけではなく、立体構造に揺らぎがみられ、様々な構造との平衡状態にあるからである。従って、天然状態にあるタンパク質に結合しない化合物であっても、揺らぎ構造の（もしくは、非天然状態にある）タンパク質に結合することで、タンパク質の機能に影響を与えることがある。
【０００４】
例えば、キナーゼ（リン酸化酵素）の一つである“DYRK1A (Dual-specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A)”は、神経疾患に関与するタンパク質（例えば微小管結合タンパク質TAU）をリン酸化する酵素として知られている。細胞内でフォールディングプロセス中の非天然状態にある“DYRK1A”に選択的に結合することで、“DYRK1A”によるTAUのリン酸化を阻害する化合物を評価するスクリーニング方法が報告されている。そのスクリーニングによって、“FINDY (下式参照)”と称される化合物が、非天然状態にある“DYRK1A”に結合して阻害活性を示す一方、安定な天然状態にある“DYRK1A”には結合しないことが報告された（非特許文献１）。さらに、“FINDY”の構造的誘導体である“dp-FINDY (下式参照)”も、安定な天然状態にある“DYRK1A”には結合しないが、非天然状態にある“DYRK1A”に選択的に結合して、“FINDY”よりも強力な阻害作用を有することが報告された（非特許文献２）。
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【０００５】
非天然状態にあるタンパク質に選択的に結合することで、そのタンパク質の機能に影響を与える機能性物質を簡便に探索する方法が提案されている（特許文献１）。特許文献１には、タンパク質に、温度変化、圧力変化、ｐH変化などの環境変化を与えることで不安定化させ、タンパク質に非天然状態をとらせ、非天然状態にあるタンパク質を機能性物質候補の存在下におき、当該タンパク質の機能的影響効果を評価することで、機能性物質を探索する手法が提案されている。この方法は、タンパク質に非天然状態を簡便にとらせることができ、有効で利便性のよい探索方法である。
【０００６】
また、タンパク質は、タンパク質をコードするRNA (mRNA) をリボソームが翻訳することで合成される。リボソームがmRNAの翻訳を開始するとポリペプチド鎖がN末端からC末端に向かって合成され、合成されたポリペプチド鎖はリボソームのペプチド鎖排出トンネルを通ってリボソーム内部から外環境に向かって放出される。リボソームによるRNAの翻訳がポリペプチド鎖のC末端まで到達すると、ポリペプチド鎖はRNAから切り離されて、リボソームから放出されたポリペプチド鎖がフォールディングされることで、天然状態にあるタンパク質となる。ここで、翻訳がポリペプチド鎖のC末端まで到達する前の合成途中のポリペプチド鎖（つまり、リボソームとRNAを介して連結しているポリペプチド鎖）をRNC（Ribosome Nascent Chain）と称することがあるが、RNCもフォールディングされて三次元構造を有しているといわれている（非特許文献３）。翻訳途中のポリペプチド鎖がフォールディングされることを、翻訳と並進したフォールディング（Co-translational Folding）などということがある。
【０００７】
実際、リボソームによる翻訳において、リボソームに結合した状態の翻訳途中のポリペプチド鎖 (RNC) がフォールディングされてできた三次元構造を構造分析したことが報告されている（非特許文献４）。非特許文献４では、無細胞タンパク質合成系においてリボソームに「組み換えフィラミン」をコードするRNA (mRNA) を翻訳させることより合成する。ここで組み換えフィラミンは、フィラミンを構成するポリペプチド鎖のC末端側に翻訳アレストペプチド配列と称されるアミノ酸配列(regulatory arrest peptide)を挿入した組み換えタンパク質である。このような組み換えフィラミンをリボソームの翻訳によって合成すると、翻訳が途中で「停止する(arrest)」ことが知られている。つまり、リボソームの翻訳により翻訳アレストペプチド配列と称されるアミノ酸配列が合成されると、その配列を構成するアミノ酸残基が、リボソーム内部のペプチド鎖排出トンネルの表面と相互作用をすることで、翻訳が停止する。非特許文献４では、そのような組み換えフィラミンをリボソームに合成させることで、翻訳途中のフィラミンを生じさせて翻訳を停止することで、翻訳途中のフィラミンの三次元構造を
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F-NMRによって分析したとしている。
【０００８】
また、翻訳アレスト配列と称される、リボソームの翻訳を停止させる配列も、いくつか提案されている（非特許文献４～１０）。翻訳を停止させる手法として、A）非特許文献４などに記載のように、リボソーム内部のペプチド鎖排出トンネルの表面と相互作用する翻訳アレストペプチド鎖を翻訳により合成する方法や、B）非特許文献９などに記載のように、RNA (mRNA)のポリペプチド鎖をコードする部分の3'末端につながる形式で、RNA (mRNA)にstem loopなどのRNA高次構造が形成される配列を加えることによって、リボソームがポリペプチド鎖を翻訳し合成しながらRNA (mRNA)上を進行する際に、上記RNA高次構造より3'末端にリボソームが進行することを抑制する方法、などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
ＷＯ２０２２／１１８９４１号
【非特許文献】
【００１０】
NATURE COMMUNICAIONS, Vol. 7, 11391
European Journal of Medicinal Chemistry 227 (2022) 113948
Biomolecules 2020, 10, 97
Nature Chemistry, VOL 14, October 2022, 1165-1173
Scientific Reports, 7, 46753
JOURNAL OF VIROLOGY, Vol. 73, No. 10, Oct. 1999, p. 8330-8337
eLife, 2019; 8: e46267.
NucleicAcidsResearch, 2015, Vol. 43, No.18, 8615-8626
eLife, 2020; 9 : e55799.
生化学, 第90巻, 第2号, 147-157, 2018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
（【００１１】以降は省略されています）

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