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公開番号2024096852
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-07-17
出願番号2024063835,2019566740
出願日2024-04-11,2019-04-02
発明の名称核酸ライブラリー作製のための組成物及び方法
出願人グアングズホウバーニングロックディーエックスシーオー., エルティーディー.
代理人個人
主分類C40B 40/06 20060101AFI20240709BHJP(コンビナトリアル技術)
要約【課題】ポリヌクレオチド配列決定のためなどの、核酸ライブラリーを作製するための方法を提供する。
【解決手段】作製方法は、a.第一のテーリング反応において、第一のテールを、鋳型非依存的重合により、複数の標的ポリヌクレオチドの各々へ追加する工程;b.第一のライゲーション反応において、第一のアダプターの鎖を第一のテールへライゲーションする工程;c.第一のアダプターの鎖へハイブリダイズされた第一のプライマーを伸長することにより、第一のアダプターの鎖を含む標的ポリヌクレオチドを増幅する工程;d.第二のテーリング反応において、鋳型非依存的重合により、複数の増幅された標的ポリヌクレオチドの各々へ、第二のテールを追加する工程;e.第二のライゲーション反応において、第二のアダプターの鎖を第二のテールへライゲーションする工程を含む。
【選択図】図9
特許請求の範囲【請求項１】
ポリヌクレオチドライブラリーの作製方法であって、この方法が：
a. 第一のテーリング反応において、第一のテールを、鋳型非依存的重合により、複数
の標的ポリヌクレオチドの各々へ追加する工程であって、ここで第一のテーリング反応が
、第一のテールにハイブリダイズするオーバーハングを含む第一のアダプターを含む工程
；
b. 第一のライゲーション反応において、第一のアダプターの鎖を第一のテールへライ
ゲーションする工程；
c. 第一のアダプターの鎖へハイブリダイズされた第一のプライマーを伸長することに
より、第一のアダプターの鎖を含む標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；
d. 第二のテーリング反応において、鋳型非依存的重合により、複数の増幅された標的
ポリヌクレオチドの各々へ、第二のテールを追加する工程であって、ここで第二のテーリ
ング反応は、第二のテールへハイブリダイズするオーバーハングを含む第二のアダプター
を含む工程；並びに
e. 第二のライゲーション反応において、第二のアダプターの鎖を第二のテールへライ
ゲーションする工程：を含む、前記方法。
続きを表示（約 830 文字）【請求項２】
前記方法が、(a)標的ポリヌクレオチドを作製するための、ポリヌクレオチドの断片化
；(b)標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端の脱リン酸化；並びに、(c)標的ポリヌ
クレオチドを作製するための、二本鎖ポリヌクレオチドの1本鎖ポリヌクレオチドへの変
性：の1以上を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記複数の標的ポリヌクレオチドが、1本鎖DNAを含む、請求項1～2のいずれか一項記載
の方法。
【請求項４】
前記標的ポリヌクレオチドが、セルフリーポリヌクレオチド、又はそれらの増幅産物を
含む、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記標的ポリヌクレオチドが、1本鎖のセルフリーDNA(cfDNA)を含む、請求項1～4のい
ずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記第一のテーリング反応における標的ポリヌクレオチドの量が、約0.1～500ng、1～1
00ng、又は5～50ngである、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記標的ポリヌクレオチドが、平均長約50～600ヌクレオチドを有する、請求項1～6の
いずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記標的ポリヌクレオチドが、工程(b)の前に、メチル化シトシン又は非メチル化シト
シンを差次的に修飾するよう処理される、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記差次的修飾が、標的ポリヌクレオチドを亜硫酸水素塩で処理することを含む、請求
項8記載の方法。
【請求項１０】
前記鋳型非依存的重合が、ポリメラーゼにより触媒される、請求項1～9のいずれか一項
記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
(配列表)
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、且つその全体が参照として本
明細書に組み込まれている配列表を含む。2019年3月28日に作製された当該ASCIIコピーは
、「232396-228002_SL.txt」と名前をつけ、且つサイズは5,661バイトである。
続きを表示（約 7,600 文字）【背景技術】
【０００２】
(背景)
複雑な核酸集団の同定及び分析は、多くの応用を伴う開発の活発な分野である。そのよ
うな分析は、超並列核酸シークエンシング(「ハイスループット配列決定」又は「次世代
配列決定」(NGS)とも称される)により大きく促進されている。少量の試料の投入及び操作
の様々な段階での誤差などの課題のために、かなり低い存在量で存在する核酸種を検出す
ることは、依然困難である。そのような課題は、可能性のある夾雑物に関する試験(例え
ば食品又は水の中)、複雑な集団における特定の細菌の存在の検出(例えば環境試験におけ
る)、及び特に早期での、疾患(例えば感染症、又は癌)に関連した核酸の存在の検出など
の状況において生じ得る。
【発明の概要】
【０００３】
(概要)
前述のことを考慮し、核酸ライブラリー作製の改善された方法が必要である。本明細書
において開示された組成物及び方法は、この必要性に対処し、且つ更に追加の利点を提供
している。
【０００４】
一つの態様において、本開示は、ポリヌクレオチドライブラリーの作製方法を提供する
。一部の実施態様において、本方法は、(a)第一のテーリング反応において、第一のテー
ルを、鋳型非依存的重合により、複数の標的ポリヌクレオチドの各々へ追加する工程であ
って、ここで第一のテーリング反応が、第一のテールにハイブリダイズするオーバーハン
グを含む第一のアダプターを含む工程；(b)第一のライゲーション反応において、第一の
アダプターの鎖を第一のテールへライゲーションする工程；(c)第一のアダプターの鎖へ
ハイブリダイズされた第一のプライマーを伸長することにより、第一のアダプターの鎖を
含む標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；(d)第二のテーリング反応において、鋳型非
依存的重合により、複数の増幅された標的ポリヌクレオチドの各々へ、第二のテールを追
加する工程であって、ここで第二のテーリング反応は、第二のテールへハイブリダイズす
るオーバーハングを含む第二のアダプターを含む工程；並びに、(e)第二のライゲーショ
ン反応において、第二のアダプターの鎖を第二のテールへライゲーションする工程：を含
む。一部の実施態様において、本方法は、(a)標的ポリヌクレオチドを作製するための、
ポリヌクレオチドの断片化；(b)標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端の脱リン酸
化；並びに、(c)標的ポリヌクレオチドを作製するための、二本鎖ポリヌクレオチドの1本
鎖ポリヌクレオチドへの変性：の1以上を含む。一部の実施態様において、複数の標的ポ
リヌクレオチドは、1本鎖DNAを含む。一部の実施態様において、標的ポリヌクレオチドは
、セルフリーポリヌクレオチド、又はそれらの増幅産物を含む。一部の実施態様において
、標的ポリヌクレオチドは、1本鎖のセルフリーDNA(cfDNA)を含む。一部の実施態様にお
いて、第一のテーリング反応における標的ポリヌクレオチドの量は、約0.1～500ng、1～1
00ng、又は5～50ngである。一部の実施態様において、標的ポリヌクレオチドは、平均長
約50～600ヌクレオチドを有する。一部の実施態様において、標的ポリヌクレオチドは、
第一のライゲーション反応の前に、標的ポリヌクレオチドを亜硫酸水素塩で処理すること
によるなど、メチル化シトシン又は非メチル化シトシンを差次的に修飾するよう処理され
る。一部の実施態様において、鋳型非依存的重合は、末端デオキシヌクレオチド転移酵素
(TdT)などのポリメラーゼにより触媒される。一部の実施態様において、第一のテールは
、第二のテールとは異なる配列を含む。一部の実施態様において、第一のテール及び第二
のテールは、同じ配列を含む。一部の実施態様において、第一のテール、第二のテール、
又は両方は、1又は2種のヌクレオチドからなる。一部の実施態様において、第一のテール
、第二のテール、又は両方は、ポリ-A、ポリ-C、及びポリ-C/Tからなる群から選択される
。一部の実施態様において、これらのテールの少なくとも1つは、2種のヌクレオチドのプ
ールから重合された2種のヌクレオチドからなり、ここでプール中の2種のヌクレオチドは
、同じ又は異なる量で存在する。一部の実施態様において、プール中の2種のヌクレオチ
ドは、約9:1、5:1、3:1、又は1:1の比である。一部の実施態様において、第一のアダプタ
ー及び第二のアダプターは、ポリヌクレオチド配列が異なる二本鎖領域を含む。一部の実
施態様において、増幅は、直線的増幅を含む。一部の実施態様において、第一及び／又は
第二のアダプターのオーバーハングは、3’-オーバーハングである。一部の実施態様にお
いて、第一及び／又は第二のアダプターのオーバーハングは、長さ6～12ヌクレオチドで
ある。一部の実施態様において、(i)第一のテーリング反応及び第一のライゲーション反
応は、同じ反応混合物中で起こるか、並びに／又は(ii)第二のテーリング反応及び第二の
ライゲーション反応は、同じ反応混合物中で起こる。
【０００５】
一部の実施態様において、本方法は、第二のアダプターの鎖にハイブリダイズされた第
二のプライマーを伸長することにより、第二のアダプターの鎖を含む標的ポリヌクレオチ
ドを増幅することを更に含む。一部の実施態様において、第一のアダプターの鎖とハイブ
リダイズする第一のプライマーの配列は、第二のアダプターとハイブリダイズする第二の
プライマーの配列とは異なる。一部の実施態様において、第二のアダプターの鎖にハイブ
リダイズされたプライマーによる増幅は、指数関数的増幅である。一部の実施態様におい
て、本方法は、第三のプライマー及び第四のプライマーによる増幅反応を更に含み、ここ
で(i)第三のプライマーは、第一のプライマーの少なくとも一部の相補体にハイブリダイ
ズし、並びに(ii)第四のプライマーは、第二のプライマーの少なくとも一部の相補体にハ
イブリダイズする。一部の実施態様において、第三のプライマーのハイブリダイズ可能な
配列は、第一のプライマーのハイブリダイズ可能な配列とは異なり、及び／又は第四のプ
ライマーのハイブリダイズ可能な配列は、第二のプライマーのハイブリダイズ可能な配列
とは異なる。一部の実施態様において、第三のプライマー及び第四のプライマーの配列は
異なる。一部の実施態様において、第三のプライマー、第四のプライマー、又は両方は、
標的ポリヌクレオチドの試料給源を同定するインデックス配列を含む。一部の実施態様に
おいて、本方法は、第二のプライマーを含む増幅の増幅産物を配列決定することを更に含
む。一部の実施態様において、本方法は、第三及び第四のプライマーを含む増幅の増幅産
物を配列決定することを更に含む。一部の実施態様において、本方法は、インデックス配
列に従い配列決定リードを群別することを更に含む。一部の実施態様において、配列決定
は、参照配列に対し、配列バリアント又はヌクレオチドメチル化の差異を検出することを
含む。
【０００６】
一つの態様において、本開示は、本明細書記載の1以上の方法において使用するための
組成物を提供する。
【０００７】
一つの態様において、本開示は、本明細書記載の方法のいずれかに従い作製されたポリ
ヌクレオチドを提供する。
【０００８】
一つの態様において、本開示は、ポリヌクレオチドライブラリーを作製するキットを提
供する。一部の実施態様において、キットは：(a)鋳型非依存的ポリメラーゼ；(b)鋳型非
依存的ポリメラーゼにより重合され得るヌクレオチドの第一プール；(c)鋳型非依存的ポ
リメラーゼにより重合され得るヌクレオチドの第二プール；(d)ポリヌクレオチドの第一
プールを重合することにより形成されるテールにハイブリダイズ可能であるオーバーハン
グを含む第一のアダプター；並びに、(e)ポリヌクレオチドの第二プールを重合すること
により形成されるテールにハイブリダイズ可能であるオーバーハングを含む第二のアダプ
ターであって、ここで第二のアダプターは、第一のアダプターとは異なる配列を含むもの
：を含む。一部の実施態様において、鋳型非依存的ポリメラーゼは、末端デオキシヌクレ
オチド転移酵素(TdT)である。一部の実施態様において、第一のプール及び第二のプール
の少なくとも一方は、他方のプールには存在しない少なくとも1種のヌクレオチドを含む
。一部の実施態様において、第一のプール及び第二のプールは、同じ1種以上のヌクレオ
チドを含む。一部の実施態様において、第一のプール、第二のプール、又は両方は、1又
は2種のヌクレオチドからなる。一部の実施態様において、第一のプール、第二のプール
、又は両方は、(i)dATPのプール、(ii)dCTPのプール、並びに(iii)dCTP及びdTTPのプール
からなる群から選択される。一部の実施態様において、第一のプール及び第二のプールの
少なくとも一方は、同じ又は異なる量で存在する2種のヌクレオチドからなる。一部の実
施態様において、プール内の2種のヌクレオチドは、約9:1、5:1、3:1、又は1:1の比であ
る。一部の実施態様において、第一のアダプター及び第二のアダプターは、ポリヌクレオ
チド配列が異なる二本鎖領域を含む。一部の実施態様において、第一及び／又は第二のア
ダプターのオーバーハングは、3’-オーバーハングである。一部の実施態様において、第
一及び／又は第二のアダプターのオーバーハングは、長さ6～12のヌクレオチドである。
一部の実施態様において、本キットは、プライマー伸長反応の条件下で、第一のアダプタ
ーの鎖にハイブリダイズ可能である第一のプライマーを更に含む。一部の実施態様におい
て、本キットは、プライマー伸長反応の条件下で、第二のアダプターの鎖にハイブリダイ
ズ可能である第二のプライマーを更に含む。一部の実施態様において、第一のアダプター
の鎖にハイブリダイズ可能である第一のプライマーの配列は、第二のアダプターにハイブ
リダイズ可能である第二のプライマーの配列とは異なる。一部の実施態様において、本キ
ットは、第三のプライマー及び第四のプライマーを更に含み、ここで(i)第三のプライマ
ーは、プライマー伸長反応の条件下で、第一のプライマーの少なくとも一部の相補体にハ
イブリダイズ可能であり、並びに、(ii)第四のプライマーは、プライマー伸長反応の条件
下で、第二のプライマーの少なくとも一部の相補体にハイブリダイズ可能である。一部の
実施態様において、第三のプライマーのハイブリダイズ可能な配列は、第一のプライマー
のハイブリダイズ可能な配列とは異なり、及び／又は第四のプライマーのハイブリダイズ
可能な配列は、第二のプライマーのハイブリダイズ可能な配列とは異なる。一部の実施態
様において、第三のプライマーのハイブリダイズ可能な配列は、第一のプライマーのハイ
ブリダイズ可能な配列に関して5’側にハイブリダイズし、及び／又は第四のプライマー
のハイブリダイズ可能な配列は、第二のプライマーのハイブリダイズ可能な配列に関して
5’側にハイブリダイズする。一部の実施態様において、第三のプライマー及び第四のプ
ライマーの配列は異なる。一部の実施態様において、第三のプライマー、第四のプライマ
ー、又は両方は、標的ポリヌクレオチドの試料給源を同定するインデックス配列を含む。
【０００９】
ポリヌクレオチドライブラリーを作製するための本発明の方法の一部の実施態様におい
て、本方法は、(a)第一のテーリング反応において、第一のテールを、鋳型非依存的重合
により、複数の標的ポリヌクレオチドの各々へ追加する工程であって、ここで第一のテー
リング反応は、第一のテールにハイブリダイズするオーバーハングを含む第一のアダプタ
ーを含む工程；(b)第一のライゲーション反応において、第一のアダプターの鎖を第一の
テールへライゲーションする工程；(c)第一のアダプターの鎖へハイブリダイズされた第
一のプライマーを伸長することにより、第一のアダプターの鎖を含む標的ポリヌクレオチ
ドを増幅する工程；並びに、(d)第二のライゲーション反応において、第二のアダプター
の鎖を、増幅された標的ポリヌクレオチドへライゲーションする工程：を含む。一部の実
施態様において、第二のライゲーション反応は、第二のテーリング反応において、第二の
テールを鋳型非依存的重合により複数の増幅された標的ポリヌクレオチドの各々へ追加す
ることを含む。一部の実施態様において、第二のテーリング反応は、第二のテールへハイ
ブリダイズするオーバーハングを含む第二のアダプターを含む。一部の実施態様において
、第二のライゲーション反応において、第二のアダプターの鎖を第二のテールへライゲー
ションする。一部の実施態様において、第二のライゲーション反応は、増幅された標的ポ
リヌクレオチドにハイブリダイズするオーバーハングを含む第二のアダプターを含む。
【００１０】
一部の実施態様において、本方法は、(a)標的ポリヌクレオチドを作製するための、ポ
リヌクレオチドの断片化；(b)標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端の脱リン酸化
；並びに、(c)標的ポリヌクレオチドを作製するための、二本鎖ポリヌクレオチドの1本鎖
ポリヌクレオチドへの変性：の1以上を含む。一部の実施態様において、複数の標的ポリ
ヌクレオチドは、1本鎖DNAを含む。一部の実施態様において、標的ポリヌクレオチドは、
セルフリーポリヌクレオチド、又はそれらの増幅産物を含む。一部の実施態様において、
標的ポリヌクレオチドは、1本鎖のセルフリーDNA(cfDNA)を含む。一部の実施態様におい
て、第一のテーリング反応における標的ポリヌクレオチドの量は、約0.1～500ng、1～100
ng、又は5～50ngである。一部の実施態様において、標的ポリヌクレオチドは、平均長約5
0～600ヌクレオチドを有する。一部の実施態様において、標的ポリヌクレオチドは、工程
(b)の前に、メチル化シトシン又は非メチル化シトシンを差次的に修飾するよう処理され
る。一部の実施態様において、差次的修飾は、標的ポリヌクレオチドを亜硫酸水素塩で処
理することを含む。一部の実施態様において、鋳型非依存的重合は、ポリメラーゼにより
触媒される。一部の実施態様において、ポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチド転移
酵素(TdT)である。一部の実施態様において、第一のテールは、第二のテールとは異なる
配列を含む。一部の実施態様において、第一のテール及び第二のテールは、同じ配列を含
む。一部の実施態様において、第一のテール、第二のテール、又は両方は、1又は2種のヌ
クレオチドからなる。一部の実施態様において、第一のテール、第二のテール、又は両方
は、ポリ-A、ポリ-C、及びポリ-C/Tからなる群から選択される。一部の実施態様において
、これらのテールの少なくとも1つは、2種のヌクレオチドのプールから重合された2種の
ヌクレオチドからなり、ここでプール中の2種のヌクレオチドは、同じ又は異なる量で存
在する。一部の実施態様において、プール中の2種のヌクレオチドは、約9:1、7:1、5:1、
3:1、又は1:1の比である。一部の実施態様において、第二のテーリング反応は省略される
。一部の実施態様において、第一のアダプター及び第二のアダプターは、ポリヌクレオチ
ド配列が異なる二本鎖領域を含む。一部の実施態様において、増幅は、直線的増幅を含む
。一部の実施態様において、第一及び／又は第二のアダプターのオーバーハングは、3’-
オーバーハングである。一部の実施態様において、第一及び／又は第二のアダプターは、
3’-オーバーハング及び5’-オーバーハングの両方を有する。一部の実施態様において、
第一及び／又は第二のアダプターの3’-オーバーハングは、長さ6～12ヌクレオチドであ
る。一部の実施態様において、第一及び／又は第二のアダプターの5’-オーバーハングは
、長さ2～6ヌクレオチドである。一部の実施態様において、(i)第一のテーリング反応及
び第一のライゲーション反応は、同じ反応混合物中で起こるか、並びに／又は(ii)第二の
テーリング反応及び第二のライゲーション反応は、同じ反応混合物中で起こる。
（【００１１】以降は省略されています）

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