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公開番号2024123010
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-10
出願番号2024087622,2022209385
出願日2024-05-30,2014-01-08
発明の名称固形支持体でのサンプル調製
出願人イルミナケンブリッジリミテッド
代理人個人
主分類C40B 40/06 20060101AFI20240903BHJP(コンビナトリアル技術)
要約【課題】標的DNAからタグ付DNAフラグメントのライブラリーを生成するときに、速度および使いやすさを提供し、そして次世代配列決定および増幅法などの核酸分析方法に容易に適用することができる方法および組成物を提供する。
【解決手段】表面に5'-タグ付けされた二重鎖標的DNAの固定化ライブラリーを生成するために固定化されたトランスポサーゼおよびトランスポゾン端部を使用するための方法および組成物が提供される。本方法は、大規模並列DNA配列決定を含め、種々のプロセスで使用するために、5'および3'タグ付されたDNAフラグメントを生成するのに有用である。
【選択図】図1a
特許請求の範囲【請求項１】
タグ付DNAフラグメントの固定化ライブラリーを調製する方法であって、
（a）固形支持体で、それに固定化されたトランスポソーム複合体を有するものを用意
することであり、前記トランスポソーム複合体には、第一ポリヌクレオチドに結合するト
ランスポサーゼが含まれ、前記第一ポリヌクレオチドには、
（i）トランスポゾン端部配列を含む3'部分、および
（ii）第一タグドメインを含む第一タグ
が含まれること、
（b）標的DNAがトランスポソーム複合体によってフラグメント化され、および第一ポリ
ヌクレオチドの3'トランスポゾン端部配列がフラグメントの少なくとも一方のストランド
の5'端に移されるところの条件下に、標的DNAを固形支持体に適用することであり、それ
によって、少なくとも一つのストランドが第一タグで5'タグ付けされる二重鎖フラグメン
トの固定化されたライブラリーが生成されること
を含む、方法。
続きを表示（約 970 文字）【請求項２】
前記第一ポリヌクレオチドは前記固形支持体に固定化される、請求項1の方法。
【請求項３】
前記トランスポソーム複合体には、前記トランスポゾン端部配列に相補的な領域を含む
第二ポリヌクレオチドが含まれる、請求項1の方法。
【請求項４】
さらに、任意の未結合核酸を除去するために固形支持体を洗浄することが含まれる、請
求項1の方法。
【請求項５】
トランスポソーム複合体は、mm
2
あたり少なくとも10
3
、10
4
、10
5
、10
6
の複合体の密度
で固形支持体に存在する、請求項1の方法。
【請求項６】
前記トランスポソーム複合体には、機能亢進性Tn5トランスポサーゼが含まれる、請求
項1の方法。
【請求項７】
前記固定化されたライブラリーにおいて二重鎖フラグメントの長さは、前記固形支持体
に存在するトランスポソーム複合体の密度を増加または減少させることによって調整され
る、請求項1の方法。
【請求項８】
前記固形支持体に存在するタグの少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80
％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％には、同じタグドメインが含まれる、請
求項1の方法。
【請求項９】
さらに、
（c）溶液においてトランスポソーム複合体を用意すること、および標的DNAがトランス
ポソーム複合体溶液によってフラグメント化されるところの条件下で前記トランスポソー
ム複合体を固定化されたフラグメントと接触させることであり、それによって一端部を有
する固定化された核酸フラグメントが溶液において得られること
が含まれる、請求項1の方法。
【請求項１０】
溶液においてトランスポソーム複合体には、第二タグが含まれ、それによって第二タグ
を有する固定化された核酸フラグメントが溶液において生成する、請求項9の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願この出願は2013年1月9日付け出願に米国仮出願第61/750682号に優先権を主
張し、それをここに参照することによりそっくりそのまま組み込む。
続きを表示（約 4,100 文字）【背景技術】
【０００２】
様々な方法および応用があり、これらについては、二重鎖（double-stranded）DNA（ds
DNA）標的分子からのフラグメント化およびからタグ付きDNA分子のライブラリーを生成す
ることが望ましい。多くの場合、目的は、DNA配列決定反応におけるテンプレートとして
使用するために、より一層小さなDNA分子（たとえば、DNAフラグメント）を、より一層大
きなdsDNA分子から生成することにある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
目下、次世代配列決定で使用するために二重鎖DNAのフラグメント化およびタグ付けに
使用される方法の多くは、DNAを浪費し、フラグメント化のために高価な器械を必要とし
、そしてフラグメント化、タグ付け、タグ付けされたDNA断片の回収のための手順は難し
く、面倒で、労力を要し、時間がかかり、非効率で、費用がかかり、サンプル核酸を比較
的大量に必要とする。さらに、これらの方法の多くは、それらが生成されたサンプル核酸
に含まれる配列を完全に代表しないタグ付きのDNAフラグメント（DNA断片）を生成する。
このように、その技術において必要とされるものは、標的DNAからタグ付DNAフラグメント
のライブラリーを生成するときに、速度および使いやすさを提供し、そして次世代配列決
定および増幅法などのような核酸分析方法に容易に適用することができる方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
ここで、固形支持体上の核酸サンプル調製のための方法および組成物を提示する。本方
法および組成物は、特に、固形支持体に固定化されるトランスポゾン組成物を用いてDNA
をフラグメント（断片ともいう）化し、およびタグ付けするための方法および組成物に関
する。ここで提示する本方法および組成物は、たとえば、タグ付けされたDNAフラグメン
トのライブラリーを生成するために、例は、次世代の配列決定法、および同類のものにお
いて使用するために有用である。若干の好ましい具体化において、本発明は、標的DNAで
、興味がある任意のdsDNAが含まれる（RNAから調製される二重鎖cDNAを含める）ものから
、任意の供給源から、ゲノム、サブゲノム、トランスクリプトーム、またはメタゲノム分
析、またはRNA発現の分析のために、固形支持体での線形ssDNAフラグメントの調製に関す
る。
【０００５】
したがって、ここに、タグ付DNAフラグメントの固定化されたライブラリーを調製する
方法を提示し、それには、（a）固形支持体で、それに固定化されたトランスポソーム複
合体を有するものを用意することであり、そこでは、トランスポソーム複合体には、第一
ポリヌクレオチドに結合するトランスポサーゼが含まれ、第一ポリヌクレオチドには、（
i）トランスポゾン端部（トランスポゾン末端ともいう）配列を含む3'部分、および（ii
）第一タグドメインを含む第一タグが含まれること、（b）標的DNAがトランスポソーム複
合体によってフラグメント化され、および第一ポリヌクレオチドの3'トランスポゾン端部
配列がフラグメントの少なくとも一方のストランドの5'端に移されるところの条件下に、
標的DNAを固形支持体に適用することであり、それによって、少なくとも一つのストラン
ドが第一タグで5'タグ付けされる二重鎖フラグメントの固定化されたライブラリーが生成
されることが含まれる。若干の実施態様では、トランスポソーム複合体には、前記トラン
スポゾン端部配列に相補的な領域を含む第二ポリヌクレオチドが含まれる。本方法はさら
に、（c）溶液においてトランスポソーム複合体を用意すること、および標的DNAが溶液に
おいてトランスポソーム複合体によってフラグメント化されるところの条件下でトランス
ポソーム複合体を固定化されたフラグメントと接触させることであり、それによって一端
部を有する固定化された核酸フラグメントが溶液において得られることが含まれる。若干
の実施態様では、溶液においてトランスポソーム複合体には、本方法が第二タグを有する
固定化された核酸フラグメント、第二タグを溶液において生成するように、第二タグが含
まれることができる。第一および第二タグは異なることができ、または同じでもよい。
【０００６】
また、ここでは、上記方法または他の方法に従って調製される固定化されたタグ付DNA
フラグメントのライブラリーを有する固形支持体を提示する。たとえば、ここでは、固形
支持体であって、それに固定化されたトランスポソーム複合体を有するものが提示され、
そこでは、トランスポソーム複合体には、第一ポリヌクレオチドに結合するトランスポサ
ーゼが含まれ、ポリヌクレオチドには、（i）トランスポゾン端部配列を含む3'部分、お
よび（ii）第一タグドメインを含む第一タグが含まれる。
【０００７】
またここでは、フローセルを生成する方法を提示し、それには、固形支持体に複数のト
ランスポソーム複合体を固定化することが含まれ、トランスポソーム複合体には、第一ポ
リヌクレオチドに結合するトランスポサーゼが含まれ、第一ポリヌクレオチドには、（i
）トランスポゾン端部配列を含む3'部分、および（ii）第一タグドメインを含む第一タグ
が含まれる。
【０００８】
本方法はさらに、固形支持体で、それに固定化された複数の第一ポリヌクレオチドを有
するものを用意すること、および固形支持体を、トランスポサーゼホロ酵素および第二ポ
リヌクレオチドと接触させることであり、第二ポリヌクレオチドには、トランスポゾン端
部配列に相補的な領域が含まれることを含む。本方法の若干の実施態様では、固定化する
ことには、（a）固形支持体で、それにカップリングされた増幅プライマーを有するもの
を用意すること、（b）第二ポリヌクレオチドを、増幅プライマーの一つにハイブリダイ
ズさせることであり、第二オリゴヌクレオチドには、トランスポゾン端部配列に相補的な
領域および第一タグに相補的な領域が含まれること、（c）第二ポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズする第一ポリヌクレオチド、固形支持体に直接固定化される第一ポリヌクレオ
チドが含まれる二本鎖（duplex）を生成するためにポリメラーゼを用いて増幅プライマー
を伸長すること、および（d）固形支持体をトランスポサーゼホロ酵素と接触させること
であり、それによってトランスポソーム複合体が固形支持体にてアセンブルされ（組み立
てられ）ることが含まれる。
【０００９】
ここではまた、微粒子の集団を提示し、それは、それに固定化されたトランスポソーム
複合体を有するものであり、トランスポソーム複合体には、第一ポリヌクレオチドおよび
第二ポリヌクレオチドに結合するトランスポサーゼが含まれ、そこでは、第一ポリヌクレ
オチドは、微粒子の表面にその5'端で固定化され、および第二ポリヌクレオチドは、第一
ポリヌクレオチドの3'端にハイブリダイズされ、およびそこでは、第一ポリヌクレオチド
には、（i）トランスポゾン端部配列を含む3'部分、および（ii）第一タグドメインを含
む第一タグが含まれる。またここでは、固定化されたタグ付DNAフラグメントを生成する
ために標的DNAを、微粒子の上記集団と接触させることを含む、タグ付DNAフラグメントの
固定化されたライブラリーを生産する方法を提示する。
【００１０】
またここでは、より一層長い配列リード（シークエンスリード）へのインデックス指向
（index-directed）アセンブリー（組立体）のためのタグ付DNAフラグメントのライブラ
リーを生成する方法を提示し、その方法には、微粒子の集団で、それに固定化されたトラ
ンスポソーム複合体を有するものを用意することであり、トランスポソーム複合体には、
微粒子に関連するインデックスドメインを含む第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌク
レオチドに結合するトランスポサーゼが含まれること、標的DNAを微粒子の集団に適用す
ることであり、それによってインデックスドメインでタグ付けされる固定化されたDNAフ
ラグメントが生成することが含まれる。上記方法の一定の実施態様において、第一ポリヌ
クレオチドは微粒子の表面にその5'端で固定化され、および第二ポリヌクレオチドは第一
ポリヌクレオチドの3'端にハイブリダイズされ、および第一ポリヌクレオチドには、（i
）トランスポゾン端部配列を含む3'部分、および（ii）インデックスドメインが含まれ、
およびそこでは、微粒子の集団には、少なくとも複数のインデックスドメインが含まれ、
およびそこでは、個々の微粒子での第一ポリヌクレオチドは同じインデックスドメインを
共有する。
（【００１１】以降は省略されています）

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