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公開番号2025107023
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-17
出願番号2024000718
出願日2024-01-05
発明の名称人工多能性幹細胞の製造方法、核酸導入キャリアおよびキット
出願人株式会社東芝,公益財団法人京都大学iPS細胞研究財団
代理人弁理士法人スズエ国際特許事務所
主分類C12N 15/88 20060101AFI20250710BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】人工多能性幹細胞の製造方法、核酸導入キャリアおよびキットを提供する。
【解決手段】実施形態に従う方法は、人工多能性幹細胞の製造方法である。当該方法は、第1の脂質粒子を線維芽細胞と1回以上接触させること、それに続き、第2の脂質粒子を前記線維芽細胞と1回以上接触させることを含む。第1の脂質粒子及び第2の脂質粒子は、それぞれ初期化因子を内包している。第1の脂質粒子の脂質成分構成比と第2の脂質粒子の脂質成分構成比は互いに異なる。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
初期化因子を内包する第１の脂質粒子を線維芽細胞と１回以上接触させること、及び
少なくとも１回の前記接触の後に、当該初期化因子を内包し、前記第１の脂質粒子とは異なる脂質成分構成比からなる第２の脂質粒子を前記線維芽細胞と１回以上接触させること、
人工多能性幹細胞を得ること
を含む人工多能性幹細胞の製造方法。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
前記第１及び第２の脂質粒子は、生分解性脂質であるFFT-10及び/又はFFT-20を含む脂質成分からなる脂質粒子である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１及び第２の脂質粒子において、前記FFT-10及び/又はFFT-20の割合が30％以上である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第1の脂質粒子の脂質成分は、前記第2の脂質粒子よりもFFT-10の含有量が多い請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第1の脂質粒子の脂質組成が、FFT-10、DOPE、DOTAP、コレステロール、DMG-PEGを含み、その％モルでの割合が、FFT-10：DOPE：DOTAP：コレステロール：DMG-PEG＝50～65：0：5～25：15～35：1～15の範囲であり、全体で100となるようにそれぞれの値が選択され、
前記第2の脂質粒子の脂質組成が、FFT-10、DOPE、DOTAP、コレステロール、DMG-PEGを含み、その％モルでの割合が、FFT-10：DOPE：DOTAP：コレステロール：DMG-PEG＝20～40：1～15：1～15：40～65：1～15の範囲であり、全体で100となるようにそれぞれの値が選択される
請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記第1の脂質粒子の脂質組成が、FFT-10、DOPE、DOTAP、コレステロール、DMG-PEGを含み、その％モルでの割合が、FFT-10：DOPE：DOTAP：コレステロール：DMG-PEG＝53～63：0：9～21：19～29：1～7の範囲であり、全体で100となるようにそれぞれの値が選択され、
前記第2の脂質粒子の脂質組成が、FFT-10、DOPE、DOTAP、コレステロール、DMG-PEGを含み、その％モルでの割合が、FFT-10：DOPE：DOTAP：コレステロール：DMG-PEG＝26～37：1～9：4～14：46～61：1～8の範囲であり、全体で100となるようにそれぞれの値が選択される
請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記第1の脂質粒子の脂質組成が、FFT-10、DOPE、DOTAP、コレステロール、DMG-PEGを含み、その％モルでの割合が、FFT-10：DOPE：DOTAP：コレステロール：DMG-PEG＝58.3:16.5:23.6:1.6 の脂質成分構成比からなる脂質粒子であり、
前記第2の脂質粒子の脂質組成が、FFT-10、DOPE、DOTAP、コレステロール、DMG-PEGを含み、その％モルでの割合が、FFT-10：DOPE：DOTAP：コレステロール：DMG-PEG＝31.7:4.5:9.0:51.4:3.4 の脂質成分構成比からなる脂質粒子である、
請求項1に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において使用するための導入キャリアセットであって、
初期化因子を内包しており、初発材料の状態にある線維芽細胞に対して適切な親和性を示すように設計された脂質組成を有する第１の脂質粒子と、
当該初期化因子を内包しており、前記第１の脂質粒子とは脂質組成が異なり、初期化が開始された状態にある線維芽細胞に対して適切な親和性を示すように設計された脂質組成を有する第２の脂質粒子と
を備えるキャリアセット。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において使用する導入キャリアセットを製造するためのキットであって、
初発材料の状態にある線維芽細胞に対して適切な親和性を示すように設計された脂質組成を有する第１の脂質粒子材料と、
前記第１の脂質粒子とは脂質組成が異なり、初期化が開始された状態にある線維芽細胞に対して適切な親和性を示すように設計された脂質組成を有する第２の脂質粒子材料と
前記第1の脂質粒子及び前記第2の脂質粒子に内包されるべき初期化因子と
を備えるキット。
【請求項１０】
更に作製マニュアルを備える請求項９に記載のキット。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、人工多能性幹細胞の製造方法、核酸導入キャリアおよびキットに関する。
続きを表示（約 3,300 文字）【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞は、一般的にiPS細胞と呼ばれ、ウイルスベクターを用いて細胞に初期化因子を発現させて製造される。ウイルスベクターを用いる場合、感染した細胞内にベクターが留まり、初期化因子を発現し続けるリスクが存在する。また、最終プロダクトにウイルスが残存することも更なるリスクとなり得る。他方、リポフェクションを利用する方法もあるが、この方法を用いた場合、安定または均質にiPS細胞を製造することが容易ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、人工多能性幹細胞の製造方法、核酸導入キャリアおよびキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
実施形態に従う方法は、人工多能性幹細胞の製造方法である。当該方法は、第１の脂質粒子を線維芽細胞と１回以上接触させること、それに続き、第２の脂質粒子を前記線維芽細胞と１回以上接触させることを含む。第１の脂質粒子及び第２の脂質粒子は、それぞれ初期化因子を内包している。第１の脂質粒子の脂質成分構成比と第２の脂質粒子の脂質成分構成比は互いに異なる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
第１の実施形態に従う方法に使用するための脂質粒子の１例を示す断面図。
第１の実施形態に従う方法を示すスキーム図。
第１の実施形態に従う方法の概念を示すイメージ図。
実験結果を示す図。
実験結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下、実施形態について、添付の図面を参照して説明する。なお、各実施形態において、実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、その説明を一部省略する場合がある。図面は模式的なものであり、各部の厚さと平面寸法との関係、各部の厚さの比率等は現実のものとは異なる場合がある。
【０００７】
（第１の実施形態）
実施形態に従う方法は、脂質粒子、例えば、リポソームを用いて人工多能性幹細胞を製造する方法である。以下、人工多能性幹細胞をiPS細胞と称する。まず、図１を参照しながら、実施形態の方法に使用する脂質粒子について説明する。図１に示される導入キャリアセット２００１は、第１の導入キャリア１０１ａと第２の導入キャリア２０１ｂとを含む。第１の導入キャリア１０１ａは、中空の脂質粒子１１ａ（例えば、リポソーム１１ａ）と、そこに内包される初期化因子１２ａとを含む。第２の導入キャリア２０１ｂは、中空の脂質粒子１１ｂ（例えば、リポソーム１１ｂ）と、そこに内包される初期化因子１２ａとを含む。脂質粒子１１ａ及び脂質粒子１１ｂは、脂質膜で形成された中空体であり、例えば、それはリポソームである。第２の導入キャリア２０１ｂの脂質粒子の脂質成分構成比は、第１の導入キャリア１０１ａの脂質粒子の脂質成分構成比とは異なる。第１の導入キャリア１０１ａは、言い換えれば、初期化因子を内包している第１の脂質粒子であり、第２の導入キャリア１０１ａは、言い換えれば、初期化因子を内包している第２の脂質粒子である。
【０００８】
当該方法は、図２に示すように、第１の脂質粒子を線維芽細胞と１回以上接触させること（S21）、それに続き、第２の脂質粒子を前記線維芽細胞と１回以上接触させること（S22）、iPS細胞得ること（S23）を含む。ここで、第１の脂質粒子及び第２の脂質粒子は、それぞれ初期化因子を内包している。また、第１の脂質粒子の脂質成分構成比と第２の脂質粒子の脂質成分構成比は互いに異なる。このような導入キャリアセット２００１により、即ち、異なる脂質成分からなる２種類の脂質粒子を用いて、初期化因子を線維芽細胞に繰り返し導入することによって、初期化前半に生じ得る初期化の揺り戻しを防ぐことが可能となる。これにより、初期化因子の効果を維持及び／又は増強することが可能となる。そして、それによってiPS細胞を効率よく製造することが可能となる。またこのような方法では、非ウイルス材料を使用してiPS細胞を製造するので、ウイルス材料を使用した場合とは異なり、感染やウイルス由来のリスクを受けることがない。安定した製造が可能であるため、均質にiPS細胞を製造することが可能となる。ここで、iPS細胞を得ることは、当該接触により、線維芽細胞がiPS細胞に実質的に移行すればよく、物理的なiPS細胞の回収を伴ってもよく、或いは伴わなくともよい。
【０００９】
当該方法の概念について図３を参照しながら更に説明する。図３に示すのは、当該方法の進行に沿った手順のイメージであり、また１つの線維芽細胞の状態の変化を経時的に示すイメージである。初発材料である線維芽細胞２０ａに対して第１の導入キャリア１０１ａを投与する（図３（ａ））。第一の導入キャリア１０１ａは、初発材料である線維芽細胞２０ａに接触し、その細胞質に、脂質粒子１１ａに内包された初期化因子１２ａを放出する（図３（ａ））。放出された初期化因子１２ａは、細胞質に初期化物質ａを形成する（図３（ａ））。初期化物質ａにより、初発材料線維芽細胞２０ａの核２１ａの情報は徐々にリプログラミングされ、細胞の状態は初期化前半へと移行される（図３（ａ）→（ｂ））。この初期化前半に、第２の導入キャリア２０１ｂが投与される（図３（ｂ））。投与された第２の導入キャリア２０１ｂは、初期化前半の状態の線維芽細胞２０ｂに接触し、その細胞質に、脂質粒子１１ｂに内包された初期化因子１２ａを放出する（図３（ｂ））。放出された初期化因子１２ａは、細胞質に更なる初期化物質ａを形成する（図３（ｂ））。初期化物質ａにより、初期化前半の線維芽細胞２０ｂの核２１ｂの情報は徐々にリプログラミングされ、細胞の状態は初期化後半へと移行される（図３（ｂ）→（ｃ））。この初期化後半に、第２の導入キャリア２０１ｂが再投与される（図３（ｃ））。投与された第２の導入キャリア２０１ｂは、初期化後半の状態の線維芽細胞２０ｃに接触し、その細胞質に、脂質粒子１１ｂに内包された初期化因子１２ａを放出する（図３（ｃ））。放出された初期化因子１２ａは、細胞質に更なる初期化物質ａを形成する（図３（ｃ））。初期化物質ａにより、初期化後半の線維芽細胞２０ｃの核２１ｃの情報は徐々にリプログラミングされ、細胞の状態は初期化が完了した状態へと移行される（図３（ｃ）→（ｄ））。これにて初期化は完了し、初期化細胞２０ｄ、即ち、iPS細胞が得られる。
【００１０】
上述した通り、初期化物質ａが細胞質に与えられることで、初発材料線維芽細胞２０ａの核２１ａの情報は徐々にリプログラミングされ、細胞の状態は、初発材料線維芽細胞２０ａ、初期化前半の線維芽細胞２０ｂ、初期化後半の状態の線維芽細胞２０ｃ、初期化細胞２０ｄ（iPS細胞）と変化していく（即ち、移行していく）（図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ））。初期化因子１２ａは、例えば、ＲＮＡである。初期化に必要な因子をＲＮＡとして導入する場合、ＲＮＡは、細胞質に留まり、タンパク質に翻訳される。翻訳されるタンパク質は、例えば、転写因子である。転写因子により、核内の遺伝子情報がリプログラミングされる。ところで、導入されたＲＮＡは、細胞質内で分解される。ＲＮＡの分解は、導入後２４時間～４８時間である。この導入後約２４時間～約４８時間に生じる細胞変化が、初期化前半に該当する。初期化後半までを含めると、初発材料である線維芽細胞が初期化を完了させて、初期化された細胞（即ち、初期化細胞（iPS細胞））になるまでの時間は、導入後の約９６時間（約４日間）である。特に初期化前半において、初期化の揺り戻しと呼ばれる現象が生じ易い。
（【００１１】以降は省略されています）

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