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公開番号2025066793
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-23
出願番号2025009638,2021565592
出願日2025-01-23,2020-12-15
発明の名称増殖性肝オルガノイド、代謝活性化肝オルガノイド、及びそれらの使用
出願人JSR株式会社,個人
代理人個人,個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20250416BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】増殖性に優れた増殖性肝オルガノイド及びその製造方法、並びに、前記増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた代謝活性化肝オルガノイド及びその製造方法を提供する。
【解決手段】増殖性肝オルガノイドの製造方法は、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ることを含み、前記増殖用培地は、インターロイキン-6ファミリーサイトカインを含む。代謝活性化肝オルガノイドの製造方法は、前記増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ることを含み、前記分化用培地が、インターロイキン-6ファミリーサイトカインを実質的に含まない。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
増殖性肝オルガノイドの製造方法であって、
ヒト肝臓由来肝実質細胞又はヒト初代凍結肝細胞を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ることを含み、
前記増殖用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカイン、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト、形質転換増殖因子－β阻害剤、骨形成タンパク質阻害剤、及びフォルスコリンを含み、
前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインは、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、カルジオトロピン－１、及び毛様体神経栄養因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、製造方法。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
前記増殖用培地中に含まれるニコチンアミドの濃度は０ｍＭであるか又は９ｍＭ以下である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、アンフィレグリン、及びヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記増殖用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄｇｅｎｅＡｂｅｒｒａｔｉｖｅｉｎＮｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記増殖用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記増殖用培地中での培養において、前記ヒト肝臓由来肝実質細胞又は前記ヒト初代凍結肝細胞と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性肝オルガノイド、代謝活性化肝オルガノイド、及びそれらの使用に関する。
本願は、２０１９年１２月１６日に、日本に出願された特願２０１９－２２６７１７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
続きを表示（約 6,000 文字）【背景技術】
【０００２】
医薬品開発の薬物動態試験において、げっ歯類を用いたインビボ試験や、げっ歯類由来の初代（凍結）肝細胞（肝実質細胞）を用いたインビトロ試験が行われている。しかしながら、種差があるためヒト特異的に発生する毒性を予測することが困難である。一方、ヒト初代（凍結）肝細胞では、数に限りがあることから、良質の肝細胞を安定して入手することが難しい。
【０００３】
薬物動態試験においては、特に肝細胞に多く存在するシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）に着目し、薬物の研究開発が進められている。ＣＹＰは、人体に存在する生体異物を代謝する主要な酵素の１つである。ＣＹＰによる薬物の代謝を解析する際に、ＨｅｐａＲＧ（登録商標、以降、「登録商標」との記載を省略する）というフランス国立衛生医学研究所（ＩＮＳＥＲＭ）で開発されたヒト肝腫瘍由来細胞株が用いられる。ＨｅｐａＲＧ細胞は、ＣＹＰについてヒト肝細胞の平均的な活性を有すると考えられている。しかしながら、ＨｅｐａＲＧ細胞はＣＹＰの活性を回復させるために、培養時間を要し、さらに、購入するためにコストがかかる。また、ＨｅｐＧ２細胞等のヒト由来の肝癌細胞株はＣＹＰの活性が低く、ＣＹＰによる代謝に関連した毒性を評価できない。また、安定した細胞数を確保する観点からヒトｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）等の多能性幹細胞由来の肝細胞を用いることも検討されている。しかしながら、ヒトｉＰＳ細胞由来の肝細胞では、ヒト由来の肝癌細胞株と同様に、ＣＹＰの活性が低く、さらに、細胞の成熟度についても初代（凍結）肝細胞よりも劣る。これらのことから、より安定に使用できるインビトロにより製造されたヒト由来の肝細胞（肝オルガノイド）が必要とされている。
【０００４】
２０１３年にＨａｎｓＣｌｅｖｅｒｓらによってマウス由来の肝細胞から肝オルガノイドを培養する方法が確立され、その後、２０１５年に同グループによってヒト由来の肝幹細胞から肝オルガノイドが確立されている。さらに、２０１８年には同グループによって前出の肝オルガノイドとは異なる細胞起源の肝幹細胞から肝オルガノイドが確立されており、肝細胞の新たな供給源として期待されている（特許文献１及び非特許文献１～非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
日本国特表２０１３－５３５２０１号公報
【非特許文献】
【０００６】
Huch M et al., “Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.”, Cell, Vol. 160, Issue 1, p299-312, 2015.
Hu H et al, “Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.”, Cell, Vol. 175, Issue 6, p1591-1606, 2018.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、増殖性に優れた増殖性肝オルガノイド及びその製造方法、並びに、前記増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた代謝活性化肝オルガノイド及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の実施態様を含む。
（１）増殖性肝オルガノイドの製造方法であって、
肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ることを含み、
前記増殖用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、製造方法。
（２）前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインが、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、カルジオトロピン－１、及び毛様体神経栄養因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１）に記載の製造方法。
（３）前記増殖用培地がニコチンアミドを実質的に含まない、前記（１）又は前記（２）に記載の製造方法。
（４）前記増殖用培地が成長因子を更に含む、前記（１）～前記（３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（５）前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、アンフィレグリン、及びヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（４）に記載の製造方法。
（６）前記増殖用培地がＷｎｔアゴニストを更に含む、前記（１）～前記（５）のいずれか一つに記載の製造方法。
（６）前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（６）に記載の製造方法。
（８）前記増殖用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（７）のいずれか一つに記載の製造方法。
（９）前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（８）に記載の製造方法。
（１０）前記増殖用培地が形質転換増殖因子－β阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（９）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１１）前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１０）に記載の製造方法。
（１２）前記増殖用培地が骨形成タンパク質阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（１１）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１３）前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄｇｅｎｅＡｂｅｒｒａｔｉｖｅｉｎＮｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１２）に記載の製造方法。
（１４）前記増殖用培地がフォルスコリンを更に含む、前記（１）～前記（１３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１５）前記増殖用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、前記（１）～前記（１４）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１６）前記増殖用培地中での培養において、前記肝幹細胞又は前記肝幹細胞を含む組織片と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、前記（１）～前記（１５）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１７）前記増殖用培地中での培養において、前記細胞外マトリックスがコラーゲン及びマトリゲルの混合物である、前記（１６）に記載の製造方法。
（１８）前記増殖用培地中での培養において、少なくとも２週間培養を行う、前記（１）～前記（１７）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１９）代謝活性化肝オルガノイドの製造方法であって、
前記（１）～前記（１８）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ることを含み、
前記分化用培地が、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない、製造方法。
（２０）前記分化用培地がニコチンアミドを実質的に含まない、前記（１９）に記載の製造方法。
（２１）前記分化用培地が成長因子を更に含む、前記（１９）又は前記（２０）に記載の製造方法。
（２２）前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、及び肝細胞増殖因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２１）に記載の製造方法。
（２３）前記分化用培地がＷｎｔアゴニストを更に含む、前記（１９）～前記（２２）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２４）前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２３）に記載の製造方法。
（２５）前記分化用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２４）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２６）前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２５）に記載の製造方法。
（２７）前記分化用培地が形質転換増殖因子－β阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２６）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２８）前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２７）に記載の製造方法。
（２９）前記分化用培地が骨形成タンパク質阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２８）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３０）前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄｇｅｎｅＡｂｅｒｒａｔｉｖｅｉｎＮｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２９）に記載の製造方法。
（３１）前記分化用培地がフォルスコリンを更に含む、前記（１９）～前記（３０）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３２）前記分化用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、前記（１９）～前記（３１）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３３）前記分化用培地が、ビタミンＤを更に含む、前記（１９）～前記（３２）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３４）前記分化用培地が、Ｎｏｔｃｈ阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（３３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３５）代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導する方法であって、
前記（１９）～前記（３４）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを誘導用培地中で培養し、前記代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導することを含み、
前記誘導用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、誘導方法。
（３６）前記（１）～前記（１８）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された、増殖性肝オルガノイド。
（３７）前記（１９）～前記（３４）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された、代謝活性化肝オルガノイド。
（３８）インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、増殖性肝オルガノイドを培養するための増殖用培地。
（３９）前記（３７）に記載の代謝活性化肝オルガノイドと被験物質とを接触させることと、
前記代謝活性化肝オルガノイドの応答を評価することと、
を含む、被験物質の評価方法。
【発明の効果】
【０００９】
上記態様の増殖性肝オルガノイドの製造方法によれば、増殖性に優れた増殖性肝オルガノイドを提供することができる。上記態様の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法によれば、前記増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた代謝活性化肝オルガノイドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１は実験例１における増殖性肝オルガノイドの顕微鏡像である。スケールバーは１００μｍである。
図２は実験例２における肝オルガノイドの顕微鏡像である。スケールバーは１００μｍである。
図３は実験例５における代謝活性化肝オルガノイドの顕微鏡像である。
図４Ａは実験例１３における細胞外マトリクスとして、マトリゲル、コラーゲン及びマトリゲルの混合物、並びに、コラーゲンを用いた場合の継代回数の比較を示すグラフである。図４Ａ中、Ｐは継代回数を示す。
図４Ｂは実験例１３における細胞外マトリクスとして、コラーゲン及びマトリゲルの混合物を用いた場合の１４回継代後であって培養１９０日後の増殖性肝オルガノイドの顕微鏡像である。
図４Ｃは図４Ｂの拡大像である。スケールバーは１００μｍである。
図４Ｄは実験例１３における細胞外マトリクスとして、マトリゲル、コラーゲン及びマトリゲルの混合物、並びに、コラーゲンを用いた場合の増殖能の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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