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公開番号2025110008
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-28
出願番号2024003682
出願日2024-01-15
発明の名称ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドの濃度の測定方法
出願人株式会社東レリサーチセンター,個人
代理人個人,個人
主分類G01N 30/88 20060101AFI20250718BHJP(測定;試験)
要約【課題】サンプル中のニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドの3成分の濃度を、高感度で測定可能な方法を提供する。
【解決手段】逆相液体クロマトグラフィーにより、サンプル中のニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD⁺)を同時に分離する工程Aと、サンプル中のニコチンアミド(NAM)を分離する工程Bを含み、前記分離工程Aにおいては移動相としてアミン系の試薬を含む揮発性の高いアンモニウム塩類の溶液と有機溶媒の混合物を用いることを特徴とする、NMN及びNAD⁺、NAMの濃度の測定方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
逆相液体クロマトグラフィーにより、サンプル中のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを同時に分離する工程Ａと、サンプル中のニコチンアミドを分離する工程Ｂを含み、前記分離工程Ａにおいては移動相としてアミン系の試薬を含む揮発性の高いアンモニウム塩類の溶液と有機溶媒の混合物を用いることを特徴とする、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドの濃度の測定方法。
続きを表示（約 680 文字）【請求項２】
前記逆相液体クロマトグラフィーの前処理として前記サンプルに強酸が添加される、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記分離工程Ａ、Ｂにおいて、多孔性グラファイトカーボンカラムが用いられる、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
前記分離工程Ｂにおいては移動相として酸を含む揮発性の高いアンモニウム塩類の溶液と有機溶媒の混合物が用いられる、請求項１に記載の測定方法。
【請求項５】
前記分離工程Ａ、Ｂにおける移動相の有機溶媒としてアセトニトリルが用いられる、請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
前記分離工程Ａ、Ｂにおいて、前記移動相におけるアセトニトリルの割合が経時的に変化され、前記分離工程Ａにおいてはアセトニトリルの割合が０～１００％（ｖ／ｖ）の範囲で、前記分離工程Ｂにおいてはアセトニトリルの割合が０～１００％（ｖ／ｖ）の範囲で漸増する勾配が利用される、請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
前記サンプルが、生体試料中から選択される、請求項１に記載の測定方法。
【請求項８】
前記サンプルが、血液、尿、脳脊髄液および前房水、または他の生体組織から選択される、請求項７に記載の測定方法。
【請求項９】
前記分離工程Ａ、Ｂにおいて分離したニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドを質量分析法によってそれぞれ定量する工程をさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の測定方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中に含まれるニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドの３成分の濃度を高感度に測定する方法に関する。
続きを表示（約 3,400 文字）【背景技術】
【０００２】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、哺乳類におけるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
＋
）の生合成に関する主要な前駆体であり、ＮＭＮの投与によってＮＡＤ
＋
の生合成が促進され、様々な加齢関連疾患の治療に使用し得ることが知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
ＮＡＤ
＋
は、従来から知られている補酵素であり、様々な生物の細胞内の還元反応において重要な役割を有するとされており、代謝、癌、ストレス応答、炎症、および老化などの、多くの生物学的経路に関連していることが数多く報告されている。また、ＮＡＤ
＋
は、加齢に伴って、膵臓、脂肪組織、骨格筋、肝臓、皮膚、および脳などの多くの組織において減少し、ＮＡＤ
＋
量の減少が、癌、心臓疾患、ＩＩ型糖尿病、肥満、高血圧、加齢黄斑変性などの加齢関連疾患の発症につながることも数多く報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献１）。
【０００４】
ＮＡＤ
＋
の生合成経路として、トリプトファンを出発物質としたde novo経路とＮＡＭを利用するサルベージ経路の２つが主に知られている。特に哺乳類では、ＮＡＤ
＋
の消費に伴い産生されるＮＡＭが再利用されるサルベージ経路がＮＡＤレベルの維持に非常に重要である。サルベージ経路においては、ビタミンＢ
３
のアミド体であるＮＡＭおよび５’－ホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）が、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）によってＮＭＮに変換され、このＮＭＮが、ニコチンアミド／ニコチン酸モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）によって、アデニンの付加を受けることによりＮＡＤ
＋
が生成されることが知られている（例えば、特許文献１）。ＮＡＤ
＋
の生合成を促進するために、ＮＡＤ
＋
の主要な前駆体であるＮＭＮを投与する試みが多数行われており、加齢関連疾患をはじめとする様々な病状の治療におけるＮＭＮの応用が注目されている（例えば、特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、ＮＭＮは生体内で速やかに代謝されてＮＡＤ
＋
などの他の代謝産物に変換されるため、血液等の生体試料中のＮＭＮを直接検出することは難しいと報告されている（例えば、特許文献１）。
【０００６】
実際の測定対象サンプルには、上述のＮＭＮ、ＮＡＤ
＋
、ＮＡＭが混在していると考えられ、サンプル中のこれら３成分の濃度を高感度で測定できれば、ＮＡＤ
＋
のサルベージ経路のより詳細なメカニズムの解明や、種々の疾患におけるバイオマーカーとしての活用、ＮＡＤ
＋
の生合成促進を目的としたＮＭＮ投与研究におけるＮＭＮ、ＮＡＤ
＋
、ＮＡＭ濃度の経時的な変化のより正確な解析に寄与できると考えられる。
【０００７】
サンプル中のＮＭＮ、ＮＡＤ
＋
、ＮＡＭの３成分の濃度の測定を試みたものとして、非特許文献２が知られている。非特許文献２では、次のような手順で濃度測定が行われている。
【０００８】
サンプルに対する前処理として、細胞数として2～4.5×10
7
（酵母の培養細胞）あるいは4～20×10
6
（哺乳類の培養細胞）程度の試料を採取し、氷冷したカリウム緩衝生理食塩水で1回洗浄し、80℃の75% エタノール／25% 10mM HEPES (v/v), pH 7.1溶液300 μLに再懸濁した後、振とう（1000 rpm、80℃、3分間）することによりエタノール可溶性代謝物を抽出する。16,000×gで10分間遠心分離し、得られた上清を40℃で乾固する。酢酸アンモニウム緩衝液に再懸濁しLC-MS/MS分析（Liquid chromatography/tandem mass spectrometry：液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析）に供する。
（ＮＭＮ及びＮＡＤ
＋
測定には
13
C標識体を、ＮＡＭ測定には
18
O標識体を内標準物質として使用）
【０００９】
LC-MS/MS条件として、下記の条件を採用している。
１．ＮＭＮ及びＮＡＤ
＋
測定では：
1) LC（Liquid chromatography：液体クロマトグラフィー）条件（アルカリ性分離）：
分析カラム:Hypercarb, 1 mm x 100 mm
カラム温度:60℃
移動相Aと移動相Bを混合した移動相が用いられている。
移動相A:0.05% (v/v) 水酸化アンモニウム含有7.5 mM 酢酸アンモニウム
移動相B:0.05% (v/v) 水酸化アンモニウム含有アセトニトリル
タイムプログラム：
時間 (分) 移動相Bの割合(%)
0 5
1.8 5
14 54
14.1 90
17.1 90
17.2 5
32.2 5
流速:0.08 mL/min
注入量:2.5 μL
測定時間:32.2 min
2) MS/MS条件：
MS/MS: Acquity TQD (Waters社製)
スキャンタイプ：MRM（Multiple reaction monitoring：多重反応モニタリング）
イオン極性：Positive
モニターイオン：
化合物名プリカーサーイオン>プロダクトイオン(m/z) CE(Collision energy)(eV)
ＮＭＮ 335>123 12
ＮＡＤ
＋
664>428 26
【００１０】
２．ＮＡＭ測定では：
1) LC条件（酸性条件）
分析カラム：Hypercarb, 2.1 mm x 100 mm
カラム温度：60℃
移動相A：0.1% (v/v) ギ酸含有10 mM 酢酸アンモニウム
移動相B：0.1% (v/v) ギ酸含有10 mM アセトニトリル
タイムプログラム：
時間(分) 移動相Bの割合(%)
0 5
1.8 5
11.2 35.9
11.3 90
13.3 90
13.4 5
23.4 5
流速:0.2 mL/min
注入量:2.5 μL
測定時間:23.4 min
2) MS/MS条件:
MS/MS: Acquity TQD (Waters社製)
スキャンタイプ:MRM
イオン極性:Positive
モニターイオン:
化合物名プリカーサーイオン>プロダクトイオン (m/z) CE (eV)
ＮＡＭ 123>96 16
（【００１１】以降は省略されています）

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