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公開番号2025105226
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-10
出願番号2023223641
出願日2023-12-28
発明の名称生体試料の観察方法
出願人株式会社リガク,学校法人金沢医科大学
代理人個人,個人
主分類G02B 21/00 20060101AFI20250703BHJP(光学)
要約【課題】生体試料の画像を照合し精密に合致させる方法の提供。
【解決手段】
X線顕微鏡及び光学顕微鏡により撮像された同一生体試料の同一測定箇所の画像を照合し合致させる方法であって、ワックスブロックに包埋された生体試料をエネルギー4～12keVのX線を用いたX線顕微鏡により撮像した画像を取得する工程と、前記X線顕微鏡により撮像された画像に含まれる当該生体試料の一部を光学顕微鏡により撮像した画像を取得する工程と、前記取得されたX線顕微鏡及び光学顕微鏡の画像から、前記生体試料における前記画像の任意観察対象領域を位置マーカーとして選択し、その位置マーカーを利用してX線顕微鏡画像と光学顕微鏡画像とを照合し合致させる工程、を含む、前記方法。
【選択図】図22
特許請求の範囲【請求項１】
Ｘ線顕微鏡及び光学顕微鏡により撮像された同一生体試料の同一測定箇所の画像を照合し合致させる方法であって、
ワックスブロックに包埋された生体試料をエネルギー４～１２ｋｅＶのＸ線を用いたＸ線顕微鏡により撮像した画像を取得する工程と、
前記Ｘ線顕微鏡により撮像された画像に含まれる当該生体試料の一部を光学顕微鏡により撮像した画像を取得する工程と、
前記取得されたＸ線顕微鏡及び光学顕微鏡の画像から、前記生体試料における前記画像の任意観察対象領域を位置マーカーとして選択し、その位置マーカーを利用してＸ線顕微鏡画像と光学顕微鏡画像とを照合し合致させる工程、
を含む、前記方法。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
前記光学顕微鏡により撮像した画像は、前記Ｘ線顕微鏡により撮像した画像と１０°以内の方位誤差で撮像された同一生体試料の同一測定箇所を撮像した画像である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記位置マーカーの選択が、生体試料における、細胞又は組織の大きさ、構造及び種類、細胞核、並びに欠陥形態のうち少なくとも１つに基づくものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
欠陥形態が、癌、繊維化、石灰化、結石、及び沈着物のうち少なくとも１つである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｘ線顕微鏡画像と光学顕微鏡画像との照合は、Ｘ線顕微鏡画像及び光学顕微鏡画像に共通に存在する位置マーカーを含む観察対象領域（基準領域）を含む基準スライス（それぞれ「ＸＲＭ基準スライス」、「ＬＭ基準スライス」という）のうちＬＭ基準スライスと、当該ＬＭ基準スライスには含まれるがＸＲＭ基準スライスには含まれない位置マーカーを含む観察対象領域であってＸＲＭ基準スライスの上下所定範囲内に現れる領域（指標領域）を含む指標スライス（「ＸＲＭ指標スライス」という）とを比較して、当該ＸＲＭ基準スライスの回転操作に基づく方位調整により行われるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
回転操作は、Ｘ線顕微鏡におけるＣＴ回転角及び／又はあおり角の画像の回転により行われるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｘ線顕微鏡画像と光学顕微鏡画像との照合は、光学顕微鏡の画像の補正工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
顕微鏡画像処理装置であって、エネルギー４～１２ｋｅＶのＸ線を用いて撮像されたワックスブロック包埋生体試料のＸ線顕微鏡画像から、前記生体試料に含まれる任意観察対象領域を特定する第一特定手段と、
前記Ｘ線顕微鏡により撮像された画像に含まれる当該生体試料の一部を光学顕微鏡画像により撮像した画像を取得して、前記第一特定手段により特定された観察対象領域に対応する領域を特定する第二特定手段と、
前記第一特定手段により特定された領域の情報と、前記第二特定手段により特定された領域の情報とを照合する手段と、
前記照合結果を出力する出力手段と、
を備える前記装置。
【請求項９】
前記第一特定手段及び前記第二特定手段は、細胞又は組織の大きさ、構造及び種類、細胞核、並びに欠陥形態のうち少なくとも１つの形態と関連付けられた領域抽出処理によって前記Ｘ線顕微鏡画像及び前記光学顕微鏡画像から前記観察対象領域を特定する、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記第一特定手段により特定された観察対象領域の位置情報を利用して、当該観察対象領域と前記第二特定手段による観察対象領域とを対応付ける手段を備える、請求項８に記載の装置。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線顕微鏡及び光学顕微鏡により撮像された同一生体試料の同一測定箇所の画像を照合し精密に合致させる方法に関する。
続きを表示（約 5,500 文字）【背景技術】
【０００２】
生体組織の病理的評価は、病理標本で切出された平面（二次元）における病理評価が主体である。しかし、病理学的変化は、組織内で立体的（三次元的）に進展する。また、病理標本を作成する際には、検体の一部は破棄され評価は不能となっている。この様な現状から、検体を三次元的に評価する方法、検体すべてを評価する方法の開発は重要な解決課題であった。
従来、生体試料を観察する方法として、顕微鏡法を用いて、生体試料を画像化する方法（特許文献１）、ラットの腎（尿細管）を撮像する方法（特許文献２）、造影剤を生体試料に浸透させて固化し、造影する方法（特許文献３）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特表２０２０－５２８５５７号公報
特開２０１４－２１１４４８号公報
国際公開２０２２／２３４８４４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、現在において、検体の病理的変化を細胞レベルの空間分解能で三次元的に評価できる実用的な観察方法は存在しない。光学顕微鏡には０．２μｍ程度と比較的高い二次元分解能、多様な染色法による正確な組織同定という利点がある反面、試料調製の際に物理的な力が加わることに起因する試料の変形（破壊的変形）や、４μｍ程度の試料厚みに起因する深さ方向の分解能不足など、顕微鏡観察に制限がある。一方、Ｘ線顕微鏡には等方的なサブミクロンの三次元分解能、試料の再利用が可能な非破壊性という利点がある反面、Ｘ線顕微鏡画像の濃淡が生体試料を構成する比較的軽い元素の電子密度を反映して決まるため、コントラストの低いグレースケール画像を与え、これに起因して組織同定に困難が生じる。そこで、Ｘ線顕微鏡と光学顕微鏡を組み合わせて上記制限や困難性を相補し合うことによる、同一生体試料の同一測定箇所を細胞レベルの空間分解能で立体観察する実用的な方法の開発が求められていた。
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、生体試料に含まれる細胞核などを位置マーカーとして利用しＸ線顕微鏡画像の回転操作に基づく方位調整を行うことにより、Ｘ線顕微鏡及び光学顕微鏡により撮像された同一生体試料の同一測定箇所の画像を照合し精密に合致させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]
Ｘ線顕微鏡及び光学顕微鏡により撮像された同一生体試料の同一測定箇所の画像を照合し合致させる方法であって、
ワックスブロックに包埋された生体試料をエネルギー４～１２ｋｅＶのＸ線を用いたＸ線顕微鏡により撮像した画像を取得する工程と、
前記Ｘ線顕微鏡により撮像された画像に含まれる当該生体試料の一部を光学顕微鏡により撮像した画像を取得する工程と、
前記取得されたＸ線顕微鏡及び光学顕微鏡の画像から、前記生体試料における前記画像の任意観察対象領域を位置マーカーとして選択し、その位置マーカーを利用してＸ線顕微鏡画像と光学顕微鏡画像とを照合し合致させる工程、
を含む、前記方法。
[２]
前記光学顕微鏡により撮像した画像は、前記Ｘ線顕微鏡により撮像した画像と１０°以内の方位誤差で撮像された同一生体試料の同一測定箇所を撮像した画像である[１]に記載の方法。
[３]
前記位置マーカーの選択が、生体試料における、細胞又は組織の大きさ、構造及び種類、細胞核、並びに欠陥形態のうち少なくとも１つに基づくものである[１]に記載の方法。
[４]
欠陥形態が、癌、繊維化、石灰化、結石、及び沈着物のうち少なくとも１つである、[３]に記載の方法。
[５]
Ｘ線顕微鏡画像と光学顕微鏡画像との照合は、Ｘ線顕微鏡画像及び光学顕微鏡画像に共通に存在する位置マーカーを含む観察対象領域（基準領域）を含む基準スライス（それぞれ「ＸＲＭ基準スライス」、「ＬＭ基準スライス」という）のうちＬＭ基準スライスと、当該ＬＭ基準スライスには含まれるがＸＲＭ基準スライスには含まれない位置マーカーを含む観察対象領域であってＸＲＭ基準スライスの上下所定範囲内に現れる領域（指標領域）を含む指標スライス（「ＸＲＭ指標スライス」という）とを比較して、当該ＸＲＭ基準スライスの回転操作に基づく方位調整により行われるものである、[１]に記載の方法。
[６]
回転操作は、Ｘ線顕微鏡におけるＣＴ回転角及び／又はあおり角の画像の回転により行われるものである、[５]に記載の方法。
[７]
Ｘ線顕微鏡画像と光学顕微鏡画像との照合は、光学顕微鏡の画像の補正工程をさらに含む、[１]に記載の方法。
[８]
顕微鏡画像処理装置であって、エネルギー４～１２ｋｅＶのＸ線を用いて撮像されたワックスブロック包埋生体試料のＸ線顕微鏡画像から、前記生体試料に含まれる任意観察対象領域を特定する第一特定手段と、
前記Ｘ線顕微鏡により撮像された画像に含まれる当該生体試料の一部を光学顕微鏡画像により撮像した画像を取得して、前記第一特定手段により特定された観察対象領域に対応する領域を特定する第二特定手段と、
前記第一特定手段により特定された領域の情報と、前記第二特定手段により特定された領域の情報とを照合する手段と、
前記照合結果を出力する出力手段と、
を備える前記装置。
[９]
前記第一特定手段及び前記第二特定手段は、細胞又は組織の大きさ、構造及び種類、細胞核、並びに欠陥形態のうち少なくとも１つの形態と関連付けられた領域抽出処理によって前記Ｘ線顕微鏡画像及び前記光学顕微鏡画像から前記観察対象領域を特定する、[８]に記載の装置。
[１０]
前記第一特定手段により特定された観察対象領域の位置情報を利用して、当該観察対象領域と前記第二特定手段による観察対象領域とを対応付ける手段を備える、[８]に記載の装置。
[１１]
前記第一特定手段及び第二特定手段は、ユーザーによる観察対象領域指定操作、前記観察対象領域に対して予め定められた優先度、及び／又はユーザーにより予め設定された優先度に基づいて前記観察対象領域を特定する、[８]に記載の装置。
[１２]
表示手段をさらに有し、
前記出力手段は、前記光学顕微鏡画像及び前記Ｘ線顕微鏡画像から抽出された観察対象領域に関する情報を前記表示手段に出力し、
前記表示手段は、前記観察対象領域に関する情報を並べて又は重ねて表示する、[８]に記載の装置。
[１３]
前記第一特定手段及び第二特定手段により特定された観察対象領域が位置マーカーを含む場合、位置マーカーを利用した回転操作に基づく方位調整により、前記光学顕微鏡画像と前記Ｘ線顕微鏡画像とを照合する照合手段を備える、[８]に記載の装置。
[１４]
コンピューターを、
エネルギー４～１２ｋｅＶのＸ線を用いて撮像されたワックスブロック包埋生体試料のＸ線顕微鏡画像から、前記生体試料に含まれる任意観察対象領域を特定する第一特定手段、
前記Ｘ線顕微鏡により撮像された画像に含まれる当該生体試料の一部を光学顕微鏡画像により撮像した画像を取得して、前記第一特定手段により特定された観察対象領域に対応する領域を特定する第二特定手段、
前記第一特定手段により特定された領域の情報と、前記第二特定手段により特定された領域の情報とを照合する手段、及び
前記照合結果を出力する出力手段、
として機能させるための顕微鏡画像処理プログラム。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、Ｘ線顕微鏡及び光学顕微鏡により撮像された同一生体試料の同一測定箇所の画像を照合し精密に合致させることが可能となった。本発明は、Ｘ線顕微鏡と光学顕微鏡の相補的な利用により同一生体試料の同一測定箇所を細胞レベルの空間分解能で実用的に立体観察する方法に必要な、精密に方位の合致した画像を提供する。Ｘ線顕微鏡画像と光学顕微鏡画像の両画像の方位をより精密に合致させることで、Ｘ線顕微鏡と光学顕微鏡の相補的な利用がはじめて可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
Ｘ線顕微鏡および光学顕微鏡による生体試料観察のための一般的な試料調製工程を示す図である。
生体試料をワックスに包埋するための包埋皿を示す図である。
生体試料をワックスに包埋して包埋ブロックを製造する工程を示す図である。
包埋カセットに包埋ブロックを配置させたことを示す図である。
ワックス造影用カセットの形状を示す図である。
Ｘ線顕微鏡測定の際の試料設置の態様を示す図である。
ブロックを設置したカセットをステージに固定させたことを示す図である。
生体試料とＸ線の照射方向との関係を示す図である。
ステージの位置を調整するための位置調整機構を示す図である。
Ｘ線顕微鏡観察を行った後に行う光学顕微鏡観察の工程を示す図である。
三次元画像から位置情報を取得するための概要を示す図である。
Ｘ線顕微鏡画像及び光学顕微鏡画像における方位調整工程の概要を示す図である。
方位調整工程のフローチャートを示す図である。
顕微鏡画像処理装置の概要を示す図である。
情報処理装置の作用を示すブロック図である。
顕微鏡画像処理装置の方位調整工程のフローチャートを示す図である。
包埋カセットに結合しない状態でＸ線顕微鏡観察した後の板状ワックスブロック試料から光学顕微鏡観察用ワックスブロックを調製する工程を示す図である。
光学顕微鏡による生体試料観察工程内にＸ線顕微鏡観察工程が組み込まれる態様を示す図である。
生体試料を用いて実際のＸ線顕微鏡三次元画像から位置情報を取得するための概要を示す図である。Ａ：光学顕微鏡観察と同じ視点になるように編集したＣＴスライス。腎小体の位置を矢印で示す。Ｂ：腎小体の部分拡大。腎臓の病変確認に必要な内部構造が確認できる。Ｃ：撮像データを１５０°分に減らして得た腎小体の部分拡大ＣＴスライス。全データの場合と本質的に同じ結果が得られた。
Ｘ線顕微鏡（上）および光学顕微鏡（下）による同一生体試料の同一測定箇所の観察例を示す図である。
光学顕微鏡（上）およびＸ線顕微鏡（下）で共通に存在する特徴的な細胞核を基準領域として指定する工程を示す図である。基準領域として用いた細胞核の位置を○印で示す。
光学顕微鏡像（上）にある特徴的な細胞核を含む観察対象領域のうち、Ｘ線顕微鏡の基準スライス（下）には細胞核を含むその領域が存在しないが前後およそ２０スライス以内には存在するような指標領域を１０か所程度指定する工程を示す図である。各領域の位置を○印で示し、基準領域（Ｆｉｄｕｃｉａｌｒｅｇｉｏｎ）をＦ、指標領域（Ｍａｒｋｅｒｒｅｇｉｏｎ）をＭ１～１０とラベルした。例として指標領域１の存在する指標スライス１を中央に挙げた。基準スライスには各指標領域をｚ投影した投影指標領域の位置を示してある。
光学顕微鏡（上）およびＸ線顕微鏡（下）の方位調整後の画像を示す図である。各領域の位置を○印で示し、基準領域（Ｆｉｄｕｃｉａｌｒｅｇｉｏｎ）をＦ、指標領域（Ｍａｒｋｅｒｒｅｇｉｏｎ）をＭ１～１０とラベルした。方位調整後の基準スライスには全ての投影指標領域に細胞核が現れている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、Ｘ線顕微鏡及び光学顕微鏡により撮像された同一生体試料の同一測定箇所の画像を照合し合致させる方法に関する。本発明の方法は、以下の工程を含む。
ワックスブロックに包埋された生体試料をエネルギー４～１２ｋｅＶのＸ線を用いたＸ線顕微鏡により撮像した画像を取得する工程、
前記Ｘ線顕微鏡により撮像された画像に含まれる当該生体試料の一部を光学顕微鏡により撮像した画像を取得する工程と、
前記取得されたＸ線顕微鏡及び光学顕微鏡の画像から、前記生体試料における前記画像の任意観察対象領域を位置マーカーとして選択し、その位置マーカーを利用してＸ線顕微鏡画像と光学顕微鏡画像とを照合し合致させる工程。
【００１０】
同一生体試料の同一測定箇所をＸ線顕微鏡及び光学顕微鏡により観察する場合において、Ｘ線顕微鏡画像における観察対象領域と、光学顕微鏡画像における観察対象領域が、相互比較が容易な程度の精度で合致するとは限らない。
そこで本発明は、光学顕微鏡画像とＸ線顕微鏡画像とを照合して、Ｘ線顕微鏡画像の回転操作に基づく方位調整を行うことにより、両顕微鏡画像を精密に合致させることを特徴とするものである。
（【００１１】以降は省略されています）

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