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公開番号2025116267
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-07
出願番号2025094547,2024017971
出願日2025-06-06,2020-08-25
発明の名称粒子の純化方法、単一粒子分注方法、及び細胞クラスター解析方法、並びそれに用いる装置
出願人株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ
代理人個人
主分類G01N 15/149 20240101AFI20250731BHJP(測定;試験)
要約【課題】本発明の1つの目的は、高濃度の粒子から短時間で目的粒子を純化する方法又は装置を提供することである。
【解決手段】前記課題は、本発明の目的粒子を純化する方法であって、高濃度の目的外粒子の中から目的粒子をソーティングする工程を含み、前記ソーティング工程を3回以上繰り返すことを特徴とする粒子の純化方法によって、解決することができる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
目的粒子を純化する方法であって、高濃度の目的外粒子の中から目的粒子をソーティングする工程を含み、前記ソーティング工程を３回以上繰り返すことを特徴とする粒子の純化方法。
続きを表示（約 1,900 文字）【請求項２】
目的粒子を純化する方法であって、高濃度の目的外粒子の中から目的粒子をソーティングする工程において、最初の目的外粒子の濃度が１０
８
個／ｍＬ以上の条件で、繰り返しソーティングを行うことを特徴とする粒子の純化方法。
【請求項３】
最初の目的粒子を含む総粒子数が１０
８
個以上である、請求項１又は２に記載の粒子の純化方法。
【請求項４】
前記粒子が細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の粒子の純化方法。
【請求項５】
前記目的粒子が蛍光染色されており、１回以上のソーティング工程の後に、目的外の粒子を蛍光染色し、その後のソーティング工程を行う、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子の純化方法。
【請求項６】
粒子１個の分取のためのソーティング工程を、更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の粒子の純化方法。
【請求項７】
単一粒子の分注方法であって、１個の粒子のソーティングごとに流路に接続した回収リザーバーに分取し、その回収リザーバーから粒子を他の容器に分注する工程を含むことを特徴とする、単一粒子分注方法。
【請求項８】
目的粒子の繰り返しソーティングが可能な、目的粒子を純化する装置であって、
前記装置は、試料液に含まれる粒子を分離するための流路チップを含み、
前記流路チップは、透明基板中に流路が形成され、そして前記流路と流体接続する試料液リザーバー、シース液リザーバー、ソーティングリザーバー、回収リザーバー、及び廃液リザーバーが形成され、そして流路内の液の流れは、各リザーバーの上部の気圧で制御され、
前記流路チップは、前記試料液リザーバーからの導入用流路と、その両側に配置された１対のシース液導入流路とが合流する合流流路を有し、その合流流路の下流には粒子を検出するための光照射領域を有し、さらにその下流には、前記合流流路の側方から接続する対向する一対の分岐流路を備え、前記１対の分岐流路の一方にはソーティングリザーバーが接続しており、分岐流路の他方には回収リザーバーが接続しており、回収リザーバーの上部は大気圧解放可能であり、前記試料液リザーバーは大気圧解放可能であり、そして
前記流路チップは、繰り返しソーティング時に、横移動可能であり、そして各リザーバー間の液移動、各リザーバーから外部への液移動、各リザーバーへの外部からの液追加をリザーバー上部から行うように構成されていることを特徴とする、目的粒子純化装置。
【請求項９】
目的粒子のソーティングが可能な、目的粒子を単一で分注する装置であって、
前記装置は、試料液に含まれる粒子を分離するための流路チップを含み、
前記流路チップは、透明基板中に流路が形成され、そして前記流路と流体接続する試料液リザーバー、シース液リザーバー、ソーティングリザーバー、回収リザーバー、及び廃液リザーバーが形成され、そして流路内の液の流れは、各リザーバーの上部の気圧で制御され、
前記流路チップは、前記試料液リザーバーからの導入用流路と、その両側に配置された１対のシース液導入流路とが合流する合流流路を有し、その合流流路の下流には粒子を検出するための光照射領域を有し、さらにその下流には、前記合流流路の側方から接続する対向する一対の分岐流路を備え、前記１対の分岐流路の一方にはソーティングリザーバーが接続しており、分岐流路の他方には回収リザーバーが接続しており、回収リザーバーの上部は大気圧解放可能であり、
１個の目的粒子の回収リザーバーへのソーティング後にソーティングを停止し、回収リザーバーから１個の目的粒子を他の容器に分注する構成を含む、目的粒子分注装置。
【請求項１０】
前記単一粒子の分注方法において、前記粒子がフッ素系オイル中のエマルジョン液滴であり、回収リザーバーにフッ素系オイル及びミネラルオイルが事前に含まれており、目的のエマルジョン液滴を蛍光信号に基づいて分取し、エマルジョン液滴を１個単位で回収リザーバーに取り込み、そして回収リザーバー底面から浮上させ、回収リザーバーのフッ素系オイルとミネラルオイルとのドーム状界面にエマルジョン液滴をトラップし、上部からエマルジョン液滴を吸い上げて、外部の容器に分注する請求項７に記載の単一粒子分注方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子の純化方法、単一粒子分注方法、及び細胞クラスター解析方法、並びそれに用いる装置に関する。
続きを表示（約 2,200 文字）【背景技術】
【０００２】
多数の夾雑細胞中の特定の細胞を検出し、遺伝子解析などを行うためには、粒子１個ごとに分注が必要となる。本発明は、総細胞数が１０
８
個程度から数１００個程度の細胞を純化する方法、又は分注する方法に関する。また、応用例として、がん患者の血液中を流れている血中循環腫瘍細胞の分取も含む。従って、異なる患者間の細胞のコンタミネーションフリーを実現する使い捨て交換型チップを利用する粒子の分取および分注技術に関する。なお、本明細書において、粒子には、細胞、又はオイル中液滴を含む粒子などが含まれる。
【０００３】
セルソーティング及びその後の分注技術に関する、従来技術及びその課題について記述する。
【０００４】
（１）従来型のＪｅｔｉｎＡｉｒ方式セルソーター技術
非特許文献１に記述されるように、ノズルから液滴を形成して、液滴中に含まれる細胞を液滴単位で分取するＪｅｔｉｎＡｉｒ方式である。
【０００５】
（２）マイクロ流路中によるセルソーティング技術
マイクロ流路によるソーティングにおけるソーティング速度は、１０００個／秒以下程度と遅い。しかし、複数の流路を利用して並列処理でスループットを向上させる技術、及び処理後の細胞を流路に戻して、再度処理し、ソーティング純度を向上する技術が、特許文献１に記載されている。
特許文献２には、流路チップが複数のソーティング部を有し、それぞれの処理を連続して実施することによって、ソーティング純度を向上する技術が記載されている。特許文献３には、リザーバー付きマイクロ流路チップを用いて、細胞群から不要な細胞をソーティングで除去し、残った細胞を再度上流のサンプルリザーバーに戻して、ソーティング処理を行う方法が記載されている。
特許文献３には、リザーバーを有するマイクロ流路チップにおける、パルス流によるソーティング技術が記載されている。さらに、特許文献４には、マイクロ流路チップにおいて、不要な細胞をソーティングで除去し、残った細胞液を廃液リザーバーから回収し、そして上流のサンプルリザーバーに戻し、ネガティブソーティングを繰り返す方法（繰り返しネガティブソーティング法）が記載されている。
【０００６】
（３）単一細胞分注技術
必要に応じて、ソーティングされた細胞は、１個単位でマルチウエルプレートに分注されることがある。この技術と課題について記載する。夾雑細胞中に含まれる目的の細胞を選別してマルチウエルプレートに細胞を分注するための方法として、ＪｅｔｉｎＡｉｒ方式セルソーターで分取した液滴を、直接にマルチウエルプレートに分注する方法が、非特許文献２で記載されている。画像認識で目的の細胞を識別して、ピエゾ圧力で、マルチウエルプレートに液滴として分注する方法が、特許文献５に記載されている。この方法の課題は、ピエゾ圧力を用いた場合、吐出可能な液滴のサイズに限界があることである。分注したい細胞を懸濁液からピペットで吸い上げ、ピペット内部を撮影して、細胞が１個入っていると認識した場合に、分注する技術が特許文献６に記載されている。
【０００７】
（４）エマルジョン液滴の分注技術
単一細胞の分注技術は、上述の通り複数の技術が存在する。しかし、オイル中のエマルジョン粒子を分注する場合、オイル中で液滴が沈降するエマルジョン粒子は、細胞と同じように分注が可能である。しかし、ドロップレットデジタルＰＣＲ又はシングルセル発現解析で利用されるフッ素系オイルは比重が大きい。従って、オイル中でエマルジョン液滴が浮上するため、上から落下させることにより、分注することが困難である。フッ素系オイル中のエマルジョン液滴を分注する方法が、特許文献７に記載されている。
【０００８】
（５）フローサイトメトリーによる細胞解析技術
非特許文献３に、従来のフローサイトメトリーの技術と解析方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
米国特許第６９７６５９０号明細書
米国特許第８９９３３１１号明細書
国際公開２０１２／０６７２５９号
国際公開ＷＯ２０１６／１８２０３４号
国際公開２０１１／１５４０４２号
国際公開２０１８／０５２１３７号
英国特許２５６６００２号明細書
米国特許第０７２６８１６７号明細書
米国特許第０９，５００，６６４号明細書
【非特許文献】
【００１０】
FACS Aria IIIパンフレット
SONY SH800Sパンフレット
https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Couter_Practical_Flow_Cytometry.pdf
Szczerba, B.M. et al., Nature volume 566, pages 553-557(2019)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
（【００１１】以降は省略されています）

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