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公開番号2025074733
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-14
出願番号2023185739
出願日2023-10-30
発明の名称細胞培養膜および測定方法
出願人豊田合成株式会社,国立大学法人東北大学
代理人弁理士法人明成国際特許事務所
主分類C12M 1/00 20060101AFI20250507BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】細胞近傍のpHを精度良く測定できる細胞培養膜を提供すること。
【解決手段】細胞培養膜は、第1面と、第1面とは反対側に位置する第2面とを有する膜本体と、第1面に重ねて形成された第1金属膜と、第2面に重ねて形成された第2金属膜との少なくとも何れか一方を含む金属膜と、金属膜に重ねて形成されたポリアニリン膜と、を備え、膜本体は、複数の孔を有し、複数の孔のそれぞれは、すり鉢状であり、少なくとも第1面に開口する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
第１面と、前記第１面とは反対側に位置する第２面とを有する膜本体と、
前記第１面に重ねて形成された第１金属膜と、前記第２面に重ねて形成された第２金属膜との少なくとも何れか一方を含む金属膜と、
前記金属膜に重ねて形成されたポリアニリン膜と、を備え、
前記膜本体は、複数の孔を有し、前記複数の孔のそれぞれは、すり鉢状であり、少なくとも前記第１面に開口する、細胞培養膜。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養膜であって、
前記複数の孔のそれぞれは、前記第２面に開口しない、非貫通孔であり、前記孔を区画する内周部を有し、
前記金属膜は、前記第２金属膜を含まず、前記第１金属膜を含み、
前記第１金属膜は、前記内周部を覆う金属内周部を有し、
前記ポリアニリン膜は、前記金属内周部を覆うポリアニリン内周部を有する、細胞培養膜。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養膜であって、
前記複数の孔のそれぞれは、前記第１面から前記第２面に亘って貫通する貫通孔であり、前記第１面に開口する第１開口部と、前記第２面に開口する第２開口部と、前記第１開口部と前記第２開口部とを接続する内周部と、を有し、
前記金属膜は、前記第２金属膜を含まず、前記第１金属膜を含み、
前記第１金属膜は、前記内周部を覆って形成された金属内周部を有し、
前記ポリアニリン膜は、前記金属内周部を覆って形成されたポリアニリン内周部を有する、細胞培養膜。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養膜であって、
前記複数の孔のそれぞれは、前記第１面から前記第２面に亘って貫通する貫通孔であり、前記第１面に開口する第１開口部と、前記第２面に開口する第２開口部と、前記第１開口部と前記第２開口部とを接続する内周部と、を有し、
前記金属膜は、前記第２金属膜を含まず、前記第１金属膜を含み、
前記第１金属膜は、前記内周部を覆って形成された金属内周部と、前記第２開口部を閉塞する金属閉塞部と、を有し、
前記ポリアニリン膜は、前記金属内周部と前記金属閉塞部とを覆って形成されたポリアニリン内周部を有し、
前記金属閉塞部は、クラックを有する、細胞培養膜。
【請求項５】
請求項３または４に記載の細胞培養膜であって、
前記複数の孔は、前記第１面における第１平均孔径が前記第２面における第２平均孔径よりも大きい、細胞培養膜。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の細胞培養膜であって、
前記膜本体は、ポリウレタンで形成されている、細胞培養膜。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞培養膜であって、
前記第２平均孔径は、７μｍ以下である、細胞培養膜。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞培養膜であって、
前記金属膜は、主に金（Ａｕ）からなる第１金属層を含む、細胞培養膜。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞培養膜であって、
前記金属膜は、前記金属膜は、主に白金（Ｐｔ）からなる第２金属層と、主にチタン（Ｔｉ）からなる第３金属層と、をさらに含む、細胞培養膜。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞培養膜を用いたｐＨの測定方法であって、
前記細胞培養膜を培養液に浸漬して、前記細胞培養膜の前記ポリアニリン膜上に細胞を培養する第１工程と、
前記培養液中に参照極を挿入し、前記金属膜を作用極として用い、前記参照極と前記作用極との間の電位差を測定する第２工程と、
測定した前記電位差を用いて、前記培養液のｐＨを求める第３工程と、を備える、測定方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞培養膜および測定方法に関する。
続きを表示（約 4,500 文字）【背景技術】
【０００２】
従来、細胞培養の状態を評価するために、培養液の物性値の測定や、培養液中の特定の物質の量の測定が行われている（例えば特許文献１）。特許文献１では、培養液の物性値であるｐＨセンサを設けた細胞培養チップが記載されている。この細胞培養チップでは、細胞が培養されるウェルの上部にｐＨセンサが配置されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特開２００４－１１３０９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の細胞培養チップでは、ウェルの底面にて細胞が培養されるため、ｐＨセンサにより測定されたｐＨは、細胞近傍のｐＨが反映されていない場合が生じ得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、以下の形態として実現することが可能である。
【０００６】
（１）本開示の一形態によれば、細胞培養膜が提供される。この細胞培養膜は、第１面と、前記第１面とは反対側に位置する第２面とを有する膜本体と、前記第１面に重ねて形成された第１金属膜と、前記第２面に重ねて形成された第２金属膜との少なくとも何れか一方を含む金属膜と、前記金属膜に重ねて形成されたポリアニリン膜と、を備え、前記膜本体は、複数の孔を有し、前記複数の孔のそれぞれは、すり鉢状であり、少なくとも前記第１面に開口する。この形態によれば、ポリアニリン膜上に細胞を培養した場合に、ポリアニリン膜は細胞と接触または近接するため、金属膜を電極として用いるとともに、ポリアニリン膜をプロトンの応答膜として用いることにより、細胞近傍におけるｐＨを精度良く測定することができる。
（２）上記形態の細胞培養膜において、前記複数の孔のそれぞれは、前記第２面に開口しない、非貫通孔であり、前記孔を区画する内周部を有し、前記金属膜は、前記第２金属膜を含まず、前記第１金属膜を含み、前記第１金属膜は、前記内周部を覆う金属内周部を有し、前記ポリアニリン膜は、前記金属内周部を覆うポリアニリン内周部を有してもよい。この形態によれば、各孔に入り込んだ細胞と接触または近接するポリアニリン膜の面積を大きくすることができるため、細胞近傍のｐＨの測定精度をさらに向上させることができる。
（３）上記形態の細胞培養膜において、前記複数の孔のそれぞれは、前記第１面から前記第２面に亘って貫通する貫通孔であり、前記第１面に開口する第１開口部と、前記第２面に開口する第２開口部と、前記第１開口部と前記第２開口部とを接続する内周部と、を有し、前記金属膜は、前記第２金属膜を含まず、前記第１金属膜を含み、前記第１金属膜は、前記内周部を覆って形成された金属内周部を有し、前記ポリアニリン膜は、前記金属内周部を覆って形成されたポリアニリン内周部を有してもよい。この形態によれば、第１面と第２面とのそれぞれに、互いに異なる種類の細胞を培養した場合に、第１面に培養された細胞と、第２面に培養された細胞とが各貫通孔を通じて接触することができるため、生体内の状態により近い細胞の状態を作ることができる。
（４）上記形態の細胞培養膜において、前記複数の孔のそれぞれは、前記第１面から前記第２面に亘って貫通する貫通孔であり、前記第１面に開口する第１開口部と、前記第２面に開口する第２開口部と、前記第１開口部と前記第２開口部とを接続する内周部と、を有し、前記金属膜は、前記第２金属膜を含まず、前記第１金属膜を含み、前記第１金属膜は、前記内周部を覆って形成された金属内周部と、前記第２開口部を閉塞する金属閉塞部と、を有し、前記ポリアニリン膜は、前記金属内周部と前記金属閉塞部とを覆って形成されたポリアニリン内周部を有し、前記金属閉塞部は、クラックを有してもよい。この形態によれば、第１面に培養された細胞と、第２面に培養された細胞とがクラックを通じて接触することができ、クラックの大きさは、第２開口部の大きさよりも小さいため、生体内の状態により近い細胞の状態を作ることが期待できる。
（５）上記形態の細胞培養膜において、前記複数の孔は、前記第１面における第１平均孔径が前記第２面における第２平均孔径よりも大きくてもよい。この形態によれば、細胞は第１開口部から孔に入り込み、第２開口部を通過することなく、孔に入り込んだ状態で培養できる可能性を高めることができる。
（６）上記形態の細胞培養膜において、前記膜本体は、ポリウレタンで形成されていてもよい。この形態によれば、第１平均孔径が前記第２面における第２平均孔径よりも大きい複数の貫通孔を有する膜本体を簡便に作製することができる。
（７）上記形態の細胞培養膜において、前記第２平均孔径は、７μｍ以下であってもよい。この形態によれば、１０μｍ程度の大きさの細胞を培養する場合、第１面と第２面とのいずれか一方に培養された細胞が、貫通孔を介して第１面と第２面とのいずれか他方に移動することを抑制することができる。
（８）上記形態の細胞培養膜において、前記金属膜は、主に金（Ａｕ）からなる第１金属層を含んでいてもよい。この形態によれば、主に金からなる第１金属層を金属膜として用いることができる。
（９）上記形態の細胞培養膜において、前記金属膜は、前記金属膜は、主に白金（Ｐｔ）からなる第２金属層と、主にチタン（Ｔｉ）からなる第３金属層と、をさらに含んでいてもよい。この形態によれば、主に金からなる第１金属層と、主に白金からなる第２金属層と、主にチタンからなる第３金属層との積層膜を金属膜として用いることができる。
（１０）上記形態の細胞培養膜を用いたｐＨの測定方法であって、前前記細胞培養膜を培養液に浸漬して、前記細胞培養膜の前記ポリアニリン膜上に細胞を培養する第１工程と、前記培養液中に参照極を挿入し、前記金属膜を作用極として用い、前記参照極と前記作用極との間の電位差を測定する第２工程と、測定した前記電位差を用いて、前記培養液のｐＨを求める第３工程と、を備えてもよい。この形態によれば、細胞培養膜上に細胞を培養した場合に、金属膜を電極として用いたｐＨの測定を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
細胞培養膜の断面の模式図。
細胞培養膜の製造工程を示すフローチャート。
ｐＨを測定する測定方法の手順を示すフローチャート。
ｐＨを測定する場合に組み立てられる測定システムを示す図。
導電性を有するポリアニリンの酸化還元反応を説明する図。
ｐＨと電位差との関係を示す図。
細胞培養膜を用いて共培養した場合の模式図。
細胞培養膜の実施形態（Ｃ１）～実施形態（Ｃ３）を示す図。
細胞培養膜の実施形態（Ｃ４）～実施形態（Ｃ６）を示す図。
細胞培養膜の実施形態（Ｃ７）および実施形態（Ｃ８）を示す図。
培養容器の他の実施形態を示す図。
細胞培養膜の製造工程の各工程において作製された膜を観察したＳＥＭ像。
細胞が培養された細胞培養膜を観察したＳＥＭ像。
細胞を含む水溶液に塩化アンモニウムを添加した場合の化学反応を説明する図。
ＰＢＳに塩化アンモニウムを添加した場合の開回路電位の測定結果。
細胞が培養された細胞培養膜を観察したＳＥＭ像。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
Ａ．実施形態：
Ａ－１．細胞培養膜の構成：
図１は、細胞培養膜１０の断面の模式図である。細胞培養膜１０は、膜本体２０と、金属膜３０と、ポリアニリン膜４０とを備える。本実施形態において、細胞培養膜１０は、ポリウレタンにより形成されている。金属膜３０は、上層から下層に向かって、主に金（Ａｕ）からなる第１金属層３１と、主に白金（Ｐｔ）からなる第２金属層３２と、主にチタン（Ｔｉ）からなる第３金属層３３とが、順に積層されて形成されている。第２金属層３２と膜本体２０との間に第３金属層３３が配置されていることにより、第１金属層３１および第２金属層３２と、膜本体２０との密着性を向上させることができる。金属膜３０の他の実施形態として、金属膜３０は、主に金（Ａｕ）からなる第１金属層３１のみで構成されていてもよい。細胞培養膜１０は、金属膜３０と、ポリアニリン膜４０とを備えるため、ポリアニリン膜４０上に細胞を培養した後に、金属膜３０を電極として用いるとともに、ポリアニリン膜４０をプロトンの応答膜として用いることにより、後述する培養液３０５のｐＨを測定することができる。
【０００９】
細胞培養膜１０は、第１面２１と、第１面２１とは反対側に位置する第２面２２とを有する膜本体２０と、膜本体２０に形成された複数の孔としての複数の貫通孔２３とを有する。複数の貫通孔２３は、第１面２１から第２面２２に亘って貫通する孔である。各貫通孔２３は、第１面２１に開口する第１開口部２３ａと、第２面２２に開口する第２開口部２３ｂと、第１開口部２３ａと第２開口部２３ｂとを接続する内周部２３ｃとを有する。細胞培養膜１０は第２開口部２３ｂを有することにより、第１面２１と第２面２２とのそれぞれに互いに種類の異なる細胞を培養した場合に、この種類の異なる細胞を接触させることができる。
【００１０】
各貫通孔２３は、すり鉢状である。貫通孔２３の第１面２１における孔径と、第２面２２における孔径とは異なる。貫通孔２３の第１面２１における孔径を第１孔径Ｄａ、貫通孔２３の第２面２２における孔径を第２孔径Ｄｂと称する。第１孔径Ｄａは、第２孔径Ｄｂよりも大きい。なお、貫通孔の場合、第２孔径Ｄｂが第１孔径Ｄａよりも小さい形状がすり鉢状に含まれる。さらに、内周部２３ｃの形状が曲面である場合と平面である場合との両方がすり鉢状に含まれる。また、複数の貫通孔２３の第１孔径Ｄａの平均値である第１平均孔径と、第２面２２における第２孔径Ｄｂの平均値である第２平均孔径とは異なる。第１平均孔径は、第２平均孔径よりも大きい。これにより、後述するように、細胞３００を貫通孔２３の内部に入り込んだ状態で培養することができる。第２平均孔径は７μｍ以下が好ましい。これにより、後述するように、細胞培養膜１０を用いて共培養を行う場合、第１細胞３０１が細胞培養膜１０に播種された後、貫通孔２３を通過しての播種された面とは反対側の面への第１細胞３０１の移動を抑制することができる。以下の記載において、貫通孔２３を通過しての播種された面とは反対側の面への第１細胞３０１の移動を、「回り込み」と呼ぶ場合がある。
（【００１１】以降は省略されています）

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