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公開番号2025060673
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-10
出願番号2024216978,2022553203
出願日2024-12-11,2021-03-06
発明の名称クラスIIのV型CRISPR系
出願人メタゲノミ,インク.
代理人弁理士法人清原国際特許事務所
主分類C12N 15/09 20060101AFI20250403BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【解決手段】本明細書には、遺伝子編集に有用な、未培養の微生物に由来する方法、組成物および系が説明されている。
【選択図】図4B
特許請求の範囲【請求項１】
遺伝子操作されたヌクレアーゼ系であって、
（ａ）ＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来しており、かつＣａｓ１２ａエンドヌクレアーゼである、ＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼと、
（ｂ）遺伝子操作されたガイドＲＮＡであって、前記遺伝子操作されたガイドＲＮＡが前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、遺伝子操作されたガイドＲＮＡと、を含む、遺伝子操作されたヌクレアーゼ系。
続きを表示（約 1,600 文字）【請求項２】
遺伝子操作されたヌクレアーゼ系であって、
（ａ）配列番号１～３４７０のうちいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼまたはそのバリアントと、
（ｂ）遺伝子操作されたガイドＲＮＡであって、前記遺伝子操作されたガイドＲＮＡが前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、遺伝子操作されたガイドＲＮＡと、を含む、遺伝子操作されたヌクレアーゼ系。
【請求項３】
遺伝子操作されたヌクレアーゼ系であって、
（ａ）配列番号３８６２～３９１３のうちいずれか１つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、クラス２のＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、
（ｂ）遺伝子操作されたガイドＲＮＡであって、前記遺伝子操作されたガイドＲＮＡが前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、遺伝子操作されたガイドＲＮＡと、を含む、遺伝子操作されたヌクレアーゼ系。
【請求項４】
前記エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガー様ドメインをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヌクレアーゼ系。
【請求項５】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３４７１、３５５１～３５５９、３６０８～３６０９、３６１２、３６３６～３６３７、３６４０～３６４１、３６４４～３６４５、３６４８～３６４９、３６５２～３６５３、３６５６～３６５７、３６６０～３６６１、３６６４～３６６７、３６７１～３６７２、～３６７８、３６９５～３６９６、３７２９～３７３０、３７３４～３７３５、および３８５１～３８５７のうちいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヌクレアーゼ系。
【請求項６】
遺伝子操作されたヌクレアーゼ系であって、
（ａ）配列番号３４７１、３５３９、３５５１～３５５９、３６０８～３６０９、３６１２、３６３６～３６３７、３６４０～３６４１、３６４４～３６４５、３６４８～３６４９、３６５２～３６５３、３６５６～３６５７、３６６０～３６６１、３６６４～３６６７、３６７１～３６７２、３６７７～３６７８、３６９５～３６９６、３７２９～３７３０、３７３４～３７３５、および３８５１～３８５７のうちいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む遺伝子操作されたガイドＲＮＡと、
（ｂ）前記遺伝子操作されたガイドＲＮＡに結合するように構成されたクラス２のＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、を含む、遺伝子操作されたヌクレアーゼ系。
【請求項７】
前記エンドヌクレアーゼが、配列番号３８６３～３９１３のいずれか１つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヌクレアーゼ系。
【請求項８】
前記ガイドＲＮＡが、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、またはヒトゲノムのポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヌクレアーゼ系。
【請求項９】
前記ガイドＲＮＡが３０～２５０ヌクレオチド長である、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヌクレアーゼ系。
【請求項１０】
前記エンドヌクレアーゼが、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端近位に１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたヌクレアーゼ系。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０２０年３月６日に出願された「クラスＩＩのＶ型ＣＲＩＳＰＲ系」と題する米国仮出願第６２／９８６，４７７号、２０２０年５月８日に出願された「クラスＩＩのＶ型ＣＲＩＳＰＲ系」と題する米国仮出願第６３／０２２，２７６号、２０２０年６月２９日に出願された「クラスＩＩのＶ型ＣＲＩＳＰＲ系」と題する米国仮出願第６３／０４５，８１５号、２０２０年８月２０日に出願された「クラスＩＩのＶ型ＣＲＩＳＰＲ系」と題する米国仮出願第６３／０６８，３１６号、２０２０年８月２４日に出願された「クラスＩＩのＶ型ＣＲＩＳＰＲ系」と題する米国仮出願第６３／０６９，６９９号、２０２０年１１月１９日に出願された「クラスＩＩのＶ型ＣＲＩＳＰＲ系」と題する米国仮出願第６３／１１６，１５７号の恩典を主張するものであり、それらのそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 6,700 文字）【背景技術】
【０００２】
クラスター化され規則的に間隔があいた、関連する短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）に加えてＣａｓ酵素は、広く普及している原核生物免疫系の成分（約４５％が細菌、約８４％が古細菌）であり、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡによりガイドされた核酸切断によって、例えば感染性ウイルスおよびプラスミドといった非自己核酸からかかる微生物を保護するように機能していることが明らかになっている。ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ要素をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）要素は、構造および長さに関しては比較的保存されるものの、そのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は非常に多様なものであり、広範な核酸相互作用ドメインを含有している。ＣＲＩＳＰＲＤＮＡ要素は１９８７年と早期に観察されていたものの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ切断能は比較的最近になってやっと認識された。このことが多様なＤＮＡ操作および遺伝子編集用途における組換えＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用につながった。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有しており、これは参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。２０２１年３月５日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は５５９２１－７１０＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２，６１７ＫＢである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
いくつかの態様では、本開示は遺伝子操作されたヌクレアーゼ系を提供し、このヌクレアーゼ系は、（ａ）ＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、該エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来しており、かつＣａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであるＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼと、（ｂ）遺伝子操作されたガイドＲＮＡであって、該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む遺伝子操作されたガイドＲＮＡと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼは、配列ＧＷｘｘｘＫを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたガイドＲＮＡは、ＵＣＵＡＣ［Ｎ
３－５
］ＧＵＡＧＡＵ（Ｎ
４
）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたガイドＲＮＡは、ＣＣＵＧＣ［Ｎ
４
］ＧＣＡＧＧ（Ｎ
３－４
）を含む。いくつかの態様では、本開示は遺伝子操作されたヌクレアーゼ系を提供し、このヌクレアーゼ系は、（ａ）配列番号１～３４７０のうちいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼまたはそのバリアントと、（ｂ）遺伝子操作されたガイドＲＮＡであって、該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む遺伝子操作されたガイドＲＮＡと、を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＲｕｖＣＩ、ＩＩ、またはＩＩＩドメインを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１～３４７０のうちいずれか１つのＲｕｖＣＩ、ＩＩまたはＩＩＩドメインまたはそのバリアントに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣＩドメインはＤ触媒残基を含む。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣＩＩドメインはＥ触媒残基を含む。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣＩＩＩドメインはＤ触媒残基を含む。いくつかの実施形態では、当該ＲｕｖＣドメインはヌクレアーゼ活性を有しない。いくつかの実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、配列番号１～３４７０のうちいずれか１つのＷＥＤＩＩドメインまたはそのバリアントに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有するＷＥＤＩＩドメインをさらに含む。いくつかの態様では、本開示は遺伝子操作されたヌクレアーゼ系を提供し、このヌクレアーゼ系は、（ａ）配列番号３８６２～３９１３ののうちいずれか１つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ、ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、クラス２のＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼであるエンドヌクレアーゼと、（ｂ）遺伝子操作されたガイドＲＮＡであって、該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む遺伝子操作されたガイドＲＮＡと、を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはジンクフィンガー様ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４７１、３５５１～３５５９、３６０８～３６０９、３６１２、３６３６～３６３７、３６４０～３６４１、３６４４～３６４５、３６４８～３６４９、３６５２～３６５３、３６５６～３６５７、３６６０～３６６１、３６６４～３６６７、３６７１～３６７２、～３６７８、３６９５～３６９６、３７２９～３７３０、３７３４～３７３５および３８５１～３８５７のうちいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様では、本開示は遺伝子操作されたヌクレアーゼ系を提供し、このヌクレアーゼ系は、（ａ）配列番号３４７１、３５３９、３５５１～３５５９、３６０８～３６０９、３６１２、３６３６～３６３７、３６４０～３６４１、３６４４～３６４５、３６４８～３６４９、３６５２～３６５３、３６５６～３６５７、３６６０～３６６１、３６６４～３６６７、３６７１～３６７２、３６７７～３６７８、３６９５～３６９６、３７２９～３７３０、３７３４～３７３５、または３８５１～３８５７のうちいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む遺伝子操作されたガイドＲＮＡと、（ｂ）該遺伝子操作されたガイドＲＮＡに結合するように構成されたクラス２のＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号３８６３～３９１３のうちいずれか１つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、真核生物、真菌、植物、哺乳動物またはヒトゲノムのポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは３０～２５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、該エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端近位に１つ以上の核局在化配列（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは配列番号３９３８～３９５３からなる群からの配列に対して少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼの配列が配列番号２１５に対して最適にアラインメントされている場合には、エンドヌクレアーゼは以下の変異：Ｓ１６８Ｒ、Ｅ１７２Ｒ、Ｎ５７７Ｒ、またはＹ１７０Ｒのうち少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼの配列が配列番号２１５に対して最適にアラインメントされている場合には、エンドヌクレアーゼは変異Ｓ１６８ＲおよびＥ１７２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼの配列が配列番号２１５に対して最適にアラインメントされている場合には、エンドヌクレアーゼは変異Ｎ５７７ＲまたはＹ１７０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼの配列が配列番号２１５に対して最適にアラインメントされている場合には、エンドヌクレアーゼは変異Ｓ１６８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＥ１７２、Ｎ５７７またはＹ１７０の変異を含まない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたヌクレアーゼ系は、
【０００５】
一本鎖または二本鎖ＤＮＡ修復テンプレートであって、５’～３’で、すなわち標的デオキシリボ核酸配列に対して５’で少なくとも２０ヌクレオチドの配列を含む第１のホモロジーアームと、少なくとも１０ヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列と、標的配列に対して３’で少なくとも２０ヌクレオチドの配列を含む第２のホモロジーアームと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のホモロジーアームまたは第２のホモロジーアームは、少なくとも４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１，０００ヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のホモロジーアームまたは第２のホモロジーアームは、原核生物、細菌、真菌または真核生物のゲノム配列に相同である。いくつかの実施形態では、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ修復テンプレートは導入遺伝子のドナーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたヌクレアーゼ系は、１つまたは２つの一本鎖ＤＮＡセグメントと隣接している二本鎖ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ修復テンプレートをさらに含む。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡセグメントは二本鎖ＤＮＡセグメントの５’末端にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡセグメントは二本鎖ＤＮＡセグメントの３’末端にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡセグメントは４～１０ヌクレオチド塩基の長さを有する。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡセグメントはスペーサー配列内の配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ配列は、バーコード、オープンリーディングフレーム、エンハンサー、プロモーター、タンパク質コード配列、ｍｉＲＮＡコード配列、ＲＮＡコード配列、または導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ配列はヌクレアーゼ切断部位と隣接している。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位はスペーサーおよびＰＡＭ配列を含む。いくつかの実施形態では、系はＭｇ
２＋
源をさらに含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは少なくとも８、少なくとも１０、または少なくとも１２塩基対のリボヌクレオチドを含むヘアピンを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンは１０塩基対のリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼは、配列番号１４１、２１５、２２９、２６１もしくは１７１１～１７２１のうちいずれか１つに対して少なくとも７５％、８０％もしくは９０％同一の配列、またはそのバリアントを含み、（ｂ）ガイドＲＮＡ構造は、配列番号３６０８～３６０９、３８５３、または３８５１～３８５７のうちいずれか１つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％または９０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは配列番号３８６３～３９１３のうちいずれか１つを含むＰＡＭに結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは配列番号３８７１を含むＰＡＭに結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムパラメータを用いるＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴアルゴリズム、またはＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムによって決定される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメータ、および１１の存在、１の伸長でのギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する、ならびに条件付き組合せスコア行列の調整を使用する、ＢＬＡＳＴＰホモロジー検索アルゴリズムによって決定される。
【０００６】
いくつかの態様では、本開示は遺伝子操作されたガイドＲＮＡを提供し、（ａ）標的ＤＮＡ分子中の標的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的セグメントと、（ｂ）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖を形成するようにハイブリダイズするヌクレオチドの２つの相補的な並びを含むタンパク質結合セグメントと、を含み、ヌクレオチドの２つの相補的な並びが、介在性ヌクレオチドと互いに共有結合され、遺伝子操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、配列番号１～３４７０のうちいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼとの複合体の形成、および標的ＤＮＡ分子の標的配列への複合体の標的化、が可能である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的セグメントは、ヌクレオチドの２つの相補的な並びの両方の３’に位置づけられている。いくつかの実施形態では、タンパク質結合セグメントは、配列番号３６０８～３６０９の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖は、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、または少なくとも１２リボヌクレオチドを含む。
【０００７】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に説明されている遺伝子操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドをコードするデオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
いくつかの態様では、本開示は、生物での発現に最適化された遺伝子操作された核酸配列を含む核酸を提供する。この核酸は、クラス２のＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードしており、未培養の微生物に由来し、該生物は未培養の生物ではない。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１～３４７０のうちいずれか１つに対して少なくとも７０％、または少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、該エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端近位に１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは配列番号３９３８～３９５３から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは配列番号３９３９を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳはエンドヌクレアーゼのＮ末端近位に存在する。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは配列番号３９３８を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳはエンドヌクレアーゼのＣ末端近位に存在する。いくつかの実施形態では、生物は原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトである。
【０００９】
いくつかの態様では、本開示は、クラス２のＶ型ＣａｓエンドヌクレアーゼまたはＣａｓ１２ａエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む遺伝子操作されたベクターを提供する。該エンドヌクレアーゼは、未培養の微生物に由来する。
【００１０】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に説明されている核酸を含む遺伝子操作されたベクターを提供する。
（【００１１】以降は省略されています）

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