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公開番号2025176187
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-12-03
出願番号2025155392,2023144527
出願日2025-09-18,2021-03-26
発明の名称近接検出アッセイのための制御
出願人オリンクプロテオミクスエービー
代理人弁理士法人池内アンドパートナーズ
主分類C12Q 1/6869 20180101AFI20251126BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】試料中の複数の分析物を検出する方法を提供する。
【解決手段】多重近接に基づく検出アッセイを行うことを含む、試料中の複数の分析物を検出する方法を提供する。前記アッセイは、共有されたハイブリダイゼーション部位を有する近接プローブの対(すなわち、異なる近接プローブ対の間で共有されたハイブリダイゼーション部位を有する近接プローブの対)を利用する。また、共有されたハイブリダイゼーション部位を有する複数の近接プローブ対を含む製品も提供され、当該製品は前記方法に使用されてもよい。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
試料中の複数の分析物を検出する方法であって、該方法は、多重近接に基づく検出アッセイを行うことを含み、前記アッセイは、
（ｉ）前記試料を、近接プローブの複数の対に接触させる工程であって、各近接プローブ対は、第１の近接プローブと第２の近接プローブとを含み、各近接プローブは、
（ａ）分析物に特異的な分析物結合ドメインと、
（ｂ）核酸ドメインとを含み、
各対における両方のプローブは、同じ分析物に特異的な分析物結合ドメインを含み、前記分析物に同時に結合することができ、かつ、各プローブ対は異なる分析物に特異的であり、
各近接プローブの前記核酸ドメインは、ＩＤ配列と、少なくとも第１のハイブリダイゼーション配列とを含み、各近接プローブの前記ＩＤ配列は異なり、
各近接プローブ対において、前記第１の近接プローブおよび前記第２の近接プローブは、対になったハイブリダイゼーション配列を含み、前記第１の近接プローブおよび前記第２の近接プローブがその分析物に結合すると、前記第１の近接プローブおよび前記第２の近接プローブのそれぞれの対になったハイブリダイゼーション配列が、互いにハイブリダイズするか、または、前記第１の近接プローブおよび前記第２の近接プローブの前記対になったハイブリダイゼーション配列の各々に対して相補的なハイブリダイゼーション配列を含む共通のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、
少なくとも一対のハイブリダイゼーション配列が、少なくとも二対の近接プローブによって共有される、工程と、
（ｉｉ）前記近接プローブの核酸ドメインを、互いにハイブリダイズさせるか、または、前記スプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、第１の近接プローブのハイブリダイゼーション配列と第２の近接プローブのハイブリダイゼーション配列とを含む連続二重鎖または不連続二重鎖を形成する工程であって、前記二本鎖は少なくとも１つの遊離３’末端を有する工程と、
（ｉｉｉ）前記二重鎖を伸長反応および／またはライゲーション反応させて、前記第１の近接プローブのＩＤ配列と第２の近接プローブのＩＤ配列とを含む伸長生成物および／またはライゲーション生成物を生成する工程と、
（ｉｖ）前記伸長生成物またはライゲーション生成物を増幅する工程と、
（ｖ）前記伸長生成物またはライゲーション生成物を検出する工程であって、前記伸長生成物またはライゲーション生成物の検出は、その中の前記ＩＤ配列の識別を含み、各伸長生成物またはライゲーション生成物の相対的な量を決定する工程と、
（ｖｉ）前記試料にどの分析物が存在するかを決定する工程であって、
（ａ）第１の近接プローブ対に属する第１の近接プローブからの第１のＩＤ配列と、第２の近接プローブ対に属する第２の近接プローブからの第２のＩＤ配列と、を含む伸長生成物および／またはライゲーション生成物は、バックグラウンドとみなされ、
（ｂ）近接プローブ対からの第１のＩＤ配列と第２のＩＤ配列とを含み、かつ前記バックグラウンドよりも多い量で存在する伸長生成物またはライゲーション生成物は、前記近接プローブ対が特異的に結合する前記分析物が前記試料中に存在することを示す、工程とを含む、方法。
続きを表示（約 830 文字）【請求項２】
前記分析物は、タンパク質であるか、または、タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分析物結合ドメインは、抗体またはその断片である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｉ）は、さらに、前記試料を、分析物に結合しない１つ以上のバックグラウ
ンドプローブと接触させる工程を含み、前記バックグラウンドプローブは、ＩＤ配列と、少なくとも一つの近接プローブとともに共有するハイブリダイゼーション配列と、を含む核酸ドメインを含み、
バックグラウンドプローブと近接プローブとの間の相互作用の結果として生成された伸長生成物および／またはライゲーション生成物が、前記工程（ｖ）で検出され、前記工程（ｖｉ）でバックグラウンドとみなされる、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＤ配列は、バーコード配列である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一対のハイブリダイゼーション配列が、単一の近接プローブ対に固有である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
１０個以下の近接プローブ対が、同じハイブリダイゼーション配列対を共有する、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
５つ以下の近接プローブ対が、同じハイブリダイゼーション配列対を共有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも２５％の近接プローブ対が、それらのハイブリダイゼーション配列対を、別の近接プローブ対と共有する、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも５０％の近接プローブ対が、それらのハイブリダイゼーション配列対を、別の近接プローブ対と共有する、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、多重近接に基づく検出アッセイ（multiplex proximity-based detection assay）を行うことを含む、試料中の複数の分析物を検出する方法を提供する。前記アッセ
イは、共有されたハイブリダイゼーション部位を有する近接プローブの対（すなわち、異なる近接プローブ対の間で共有されたハイブリダイゼーション部位を有する近接プローブの対）を利用する。また、共有されたハイブリダイゼーション部位を有する複数の近接プローブ対を含む製品も提供され、当該製品は本明細書に開示される方法に使用されてもよい。
続きを表示（約 4,200 文字）【０００２】
背景技術
現代のプロテオミクス法は、少量の試料の中で多数の異なるタンパク質（またはタンパク質複合体）を検出する能力を必要とする。これを達成するために、多重分析を行う必要がある。試料中のタンパク質の多重検出ができるであろう一般的な方法としては、近接伸長アッセイ（proximity extension assay、PEA）および近接ライゲーションアッセイ（proximity extension assay、PLA）がある。ＰＥＡおよびＰＬＡは、ＷＯ０１／６１０３７に記載され、ＰＥＡはさらに、ＷＯ０３／０４４２３１、ＷＯ２００４／０９４４５６、ＷＯ２００５／１２３９６３、ＷＯ２００６／１３７９３２、およびＷＯ２０１３／１１３６９９に記載されている。
【０００３】
ＰＥＡおよびＰＬＡは近接アッセイであり、「近接プロービング」の原理に依拠するものである。これらの方法において、分析物は、複数（すなわち、２つ以上、一般には２つまたは３つ）のプローブの結合によって検出され、プローブが分析物と結合することで近接する（ゆえに「近接プローブ」と称される）と、シグナルが生成される。典型的には、近接プローブの少なくとも１つが、当該プローブの分析物結合ドメイン（または分析物結合部）に連結した（linked）核酸ドメイン（または核酸部）を含み、シグナルの生成には、核酸ドメイン間の相互作用、および／または、それらと他のプローブ（単数または複数）に保持されているさらなる機能部（functional moiety）との間の相互作用が関与する
。したがって、シグナルの生成は、プローブ間の（より具体的には、これらのプローブが保持している核酸またはその他の機能部／機能性ドメイン間の）相互作用によって決まり、よって、シグナルは、必要なプローブが分析物に結合した場合にのみ生成され、このようにして検出システムの特異性を向上している。
【０００４】
ＰＥＡにおいて、プローブ対の分析物結合ドメインに連結した核酸部は、前記プローブが近接すると（すなわち、標的に結合すると）互いにハイブリダイズし、核酸ポリメラーゼを使用して伸長する。プローブ対の中の前記プローブの核酸部は、相補的な「ハイブリダイゼーション部位」を含み、それらは互いにハイブリダイズする。その伸長生成物はレポーター核酸を形成し、それを検出することによって、対象試料中に特定の分析物（関連するプローブ対が結合した分析物）が存在することを示す。
【０００５】
ＰＬＡにおいて、プローブ対のプローブが標的と連結すると、前記プローブ対の分析物結合ドメインに結合した核酸部が近接し、それらは共にライゲーションしてもよく、あるいは、近接すると前記核酸ドメインにハイブリダイズすることが可能な、個別に添加されたオリゴヌクレオチドのライゲーションの鋳型として共に働いてもよい。ＰＬＡ法において、少なくとも１つの「スプリント」オリゴヌクレオチドが提供され、それは近接プローブ核酸部を架橋する。前記スプリントオリゴヌクレオチドは、プローブ核酸ドメイン上の「ハイブリダイゼーション部位」に対して相補的な配列を含む。プローブ核酸部をスプリ
ントオリゴヌクレオチドへ結合することは、前記２つのプローブ核酸部のライゲーションを可能にする。あるいは、上記のように、第２のスプリント分子が第１のスプリントに付加またはライゲーションされてもよい。前記ライゲーション生成物は増幅され、レポーター核酸として働く。
【０００６】
バーコード配列またはプライマーもしくはプローブ結合部位などの固有の識別子（ＩＤ）配列を各プローブの核酸部に含めることにより、ＰＥＡまたはＰＬＡを使用した多重分析物検出を達成してもよい。特定の分析物に対応するレポーター核酸分子を、それが含むＩＤ配列によって識別してもよい。
【０００７】
近接アッセイでは、いくつかの「バックグラウンド」（すなわち偽陽性）シグナルは避けられない。反応液中の結合していない近接プローブとの、またはそれらの間での、ランダムな相互作用の結果、バックグラウンドシグナルが発生することがある。現在は、近接反応におけるバックグラウンドシグナルのレベルを、別のネガティブコントロールを使用して決定する。前記ネガティブコントロールは、近接アッセイを緩衝剤のみ（すなわち、試料無し）のものを使用して行うため、シグナルがすべてバックグラウンドシグナルとなる。前記ネガティブコントロールに対して実験のアッセイを比較することにより、真のポジティブシグナルが決定できる。
【０００８】
本発明は、改良されたバックグラウンドコントロールを使用して多重近接アッセイを行う方法を提供する。この方法において、異なる近接プローブ対が、ハイブリダイゼーション部位を共有する。これにより、同じハイブリダイゼーション部位を共有する非結合プローブすべての間で「バックグラウンド」シグナルの形成が促される。生成されたレポーター核酸からのシグナルはすべて、まとめて（真陽性も偽陽性も）読まれる。前記の結果得られたレポーター核酸が、対になっているバーコード配列（すなわち、それぞれが、同じ分析物に対応し、真陽性シグナルを示しているバーコード配列）か、または対になっていないバーコード配列（すなわち、異なる分析物に対応し、偽陽性シグナルを示しているバーコード配列）かのどちらを有しているのかに基づいて、真陽性シグナルを偽陽性シグナルから見分けることができる。前記反応で生じた偽陽性シグナルのレベルはバックグラウンドのレベルを示し、これは、バックグラウンドのレベルを決定するための別のネガティブコントロールはもう行う必要が無く、アッセイ全体を簡便にするということを意味する。
【０００９】
バックグラウンドを決定するために共有されたハイブリダイゼーション部位を使用することはまた、異なるハイブリダイゼーション部位の間のパフォーマンスの違いを軽減することにもなる。異なるハイブリダイゼーション部位の対は、他と比較して多かれ少なかれ強く相互に作用し、その結果、異なるレベルのバックグラウンドがハイブリダイゼーション部位のそれぞれの対から生じる。前記共有されたハイブリダイゼーション部位は、各ハイブリダイゼーション部位対から生じたバックグラウンドのレベルがそれぞれ個々に決定できるようにし、その結果、バックグラウンドのレベルのより正確な判定が算出される。本発明はこのように、近接アッセイにおける偽陽性の結果の制御のための、より簡単で正確な手段を提供する。
【００１０】
発明の概要
このために、本発明は第一の態様において、多重の近接度に基づく検出アッセイを行うことを含む、試料中の複数の分析物を検出する方法を提供し、前記アッセイは、
（ｉ）前記試料を、近接プローブの複数の対に接触させる工程であって、各近接プローブ対は、第１の近接プローブと第２の近接プローブとを含み、各近接プローブは、
（ａ）分析物に特異的な分析物結合ドメインと、
（ｂ）核酸ドメインとを含み、
各対における両方のプローブは、同じ分析物に特異的な分析物結合ドメインを含み、前記分析物に同時に結合することができ、かつ、各プローブ対は他とは異なる分析物に特異的であり、
各近接プローブの前記核酸ドメインは、ＩＤ配列と、少なくとも第１のハイブリダイゼーション配列とを含み、各近接プローブの前記ＩＤ配列は異なり、
各近接プローブ対において、前記第１の近接プローブおよび前記第２の近接プローブは、対になったハイブリダイゼーション配列を含むため、前記第１の近接プローブおよび前記第２の近接プローブがその分析物に結合すると、前記第１の近接プローブおよび前記第２の近接プローブのそれぞれの対になったハイブリダイゼーション配列が、互いにハイブリダイズするか、または、前記第１の近接プローブおよび前記第２の近接プローブの前記対になったハイブリダイゼーション配列の各々に対して相補的なハイブリダイゼーション配列を含む共通のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするようになっており、
少なくとも一対のハイブリダイゼーション配列が、少なくとも二対の近接プローブによって共有される、工程と、
（ｉｉ）前記近接プローブの核酸ドメインを、互いにハイブリダイズさせるか、または、前記スプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、第１の近接プローブのハイブリダイゼーション配列と第２の近接プローブのハイブリダイゼーション配列とを含む連続二重鎖または不連続二重鎖を形成する工程であって、前記二本鎖は少なくとも１つの遊離３’末端を有する工程と、
（ｉｉｉ）前記二重鎖を伸長反応および／またはライゲーション反応させて、前記第１の近接プローブのＩＤ配列と第２の近接プローブのＩＤ配列とを含む伸長生成物および／またはライゲーション生成物を生成する工程と、
（ｉｖ）前記伸長生成物またはライゲーション生成物を増幅する工程と、
（ｖ）前記伸長生成物またはライゲーション生成物を検出する工程であって、前記伸長生成物またはライゲーション生成物の検出は、その中の前記ＩＤ配列の識別を含み、各伸長生成物またはライゲーション生成物の相対的な量を決定する工程と、
（ｖｉ）前記試料にどの分析物が存在するかを決定する工程であって、
（ａ）第１の近接プローブ対に属する第１の近接プローブからの第１のＩＤ配列と、第２の近接プローブ対に属する第２の近接プローブからの第２のＩＤ配列と、を含む伸長生成物および／またはライゲーション生成物がバックグラウンドとみなされ、
（ｂ）近接プローブ対からの第１のＩＤ配列と第２のＩＤ配列とを含み、かつ前記バックグラウンドよりも多い量で存在する伸長生成物またはライゲーション生成物は、前記近接プローブ対が特異的に結合する前記分析物が前記試料中に存在することを示す、工程とを含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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