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公開番号2025176186
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-12-03
出願番号2025155384,2024565965
出願日2025-09-18,2024-07-25
発明の名称ガイドRNAおよびその利用
出願人C4U株式会社,国立大学法人東京大学,国立研究開発法人理化学研究所
代理人弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
主分類C12N 15/09 20060101AFI20251126BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】新規形態のガイドRNAを利用したタイプI CRISPR-Casシステムを確立すること。
【解決手段】スペーサー配列の5’側には、カスケード複合体を形成するためのプロセシングにより切断されるリピート配列が配置されており、かつ、スペーサー配列の3’側には、リピート配列が配置されていないか、または、カスケード複合体を形成するためのプロセシングにより切断されない配列が配置されているガイドRNA、および当該ガイドRNAを利用したタイプI CRISPR-Casシステム。
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項１】
タイプＩＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのガイドＲＮＡであって、
（ａ）スペーサー配列の５’側には、Ｃａｓ６タンパク質またはＣａｓ５タンパク質により切断されるリピート配列が配置されており、かつ、スペーサー配列の３’側には、Ｃａｓ６タンパク質またはＣａｓ５タンパク質により切断されるリピート配列以外の任意の配列が配置されており、
（ｂ）前記スペーサー配列は、真核細胞内の標的ＤＮＡに相補的な配列であり、かつ、
（ｃ）真核細胞内において、Ｃａｓ３タンパク質およびカスケードタンパク質とともに存在させた場合に、前記スペーサー配列の５’側に配置されたリピート配列の、Ｃａｓ６タンパク質またはＣａｓ５タンパク質による切断を経て、前記ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ３タンパク質、およびカスケードタンパク質を含む複合体が形成される、ガイドＲＮＡ。
続きを表示（約 370 文字）【請求項２】
請求項１に記載のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のガイドＲＮＡを含むタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
【請求項５】
標的ＤＮＡが編集された試料を製造する方法であって、請求項４に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを標的ＤＮＡを含む試料に接触させることを含み、前記試料が真核細胞（但し、ヒト個体中の細胞、ヒト生殖細胞、およびヒト胚細胞は除く）である、方法。
【請求項６】
試料中の標的ＤＮＡを検出する方法であって、請求項４に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを試料に接触させることを含み、前記試料が真核細胞（但し、ヒト個体中の細胞は除く）である、方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、タイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに用いられる新規形態のガイドＲＮＡおよびその利用に関する。
続きを表示（約 1,500 文字）【背景技術】
【０００２】
ゲノム編集技術は、動物や植物の細胞の中でゲノムＤＮＡ配列を特異的に切断し、内在の修復機構を利用することで、任意の配列に自由に書き換える技術である。バイオサイエンス研究だけでなく、農作物や畜産動物の品種改良、再生医療や遺伝子治療など、世界中でその利用が広がっている。
【０００３】
細菌や古細菌が持つＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、複数のタンパク質の複合体により標的配列を切断するクラス１と、一つのタンパク質により標的配列を切断するクラス２に分かれる。これまでゲノム編集ツールとして開発されてきたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３は、すべてクラス２に分類される。
【０００４】
一方、最近、クラス１に属するタイプＩＣＲＩＳＰＲであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３が真核細胞のゲノム編集ツールとして利用できることが見出された（特許文献１）。このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにおいては、ヒト培養細胞などの真核細胞で標的配列周辺に数百～数ｋｂもの広範な欠失変異を高効率で導入できることが判明している。また、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９と比較して、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）における標的認識配列が長く、非特異的な切断が生じにくいことから、安全性が高いと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
国際公開２０１８／２２５８５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１の実施例に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムでは、完全長のリピート配列を両末端に有するプレｃｒＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｒＲＮＡ）が用いられており、これにより真核細胞内でプレｃｒＲＮＡのプロセシングを生じさせ、機能的なゲノム編集複合体を形成させることに成功している。しかしながら、プレｃｒＲＮＡのプロセシング過程は十分に検討されているとは言い難く、機能的なゲノム編集複合体の形成に必要なガイドＲＮＡの構造は、完全には解明されていない。
【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、真核細胞においてタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを機能させるために必要なガイドＲＮＡの構造の詳細を明らかにし、新規形態のガイドＲＮＡを利用したタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが複合体として機能するためには、ガイドＲＮＡの５’側リピート配列がプロセシングによる切断を受けることが必要である一方、３’側リピート配列のプロセシングは必要ではなく、プロセシングによる切断後のリピート配列を用いた場合でも、機能的な複合体を形成し得ることを解明した。
【０００９】
本発明者らは、この機序について、さらに解析を進めた結果、３’側リピート配列を完全に欠損させた短縮型ｃｒＲＮＡを用いた場合でも、同様に、機能的な複合体が形成され、核酸の検出やＤＮＡの編集が可能であることが判明した。
【００１０】
さらに、本発明者は、この機序が、特定のサブタイプに限定されず、タイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに共通することをも見出し、本発明を完成するに至った。
（【００１１】以降は省略されています）

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