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公開番号2025176009
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-12-03
出願番号2025128308,2023148314
出願日2025-07-31,2006-10-18
発明の名称配列特異性およびDNA-結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
出願人デューク大学
代理人弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
主分類A61K 48/00 20060101AFI20251126BHJP(医学または獣医学;衛生学)
要約【課題】病原体感染の治療のための、ならびに診断学および研究におけるインビトロ応用のための遺伝子治療法を提供する。
【解決手段】野生型I-CREIメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼを用いて、真核細胞において遺伝子治療によりヒトの疾患を治療する方法であって、前記組み換えメガヌクレアーゼは、特定の配列のI-CREIメガヌクレアーゼの残基2-153に対し少なくとも85%の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、特定の配列から成る群より選ばれるI-CREIメガヌクレアーゼ認識配列内の半分部位と、少なくとも1塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を有し、排外的修飾ではない少なくとも一つの修飾を含む、方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対し少なくとも８５％
の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５から成る群より選ばれるＩ－ＣＲ
ＥＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分
部位に対して特異性を有し、
排外的修飾ではない表５の少なくとも一つの修飾を含む、組み換えメガヌクレアーゼ。
続きを表示（約 7,400 文字）【請求項２】
野生型Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０に対し少なくとも８５％
の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
配列番号７及び配列番号８から成る群より選ばれるＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼ認識
配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を有し
、
排外的修飾ではない表７の少なくとも一つの修飾を含む、組み換えメガヌクレアーゼ。
【請求項３】
野生型Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼと比べ、認識配列に対する特異性が変更された組
み換えメガヌクレアーゼであって、
配列番号９のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの残基３－１８６に対し少なくとも８５％
の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
配列番号１０及び配列番号１１から成る群より選ばれるＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼ
認識配列と、少なくとも１塩基対異なる認識配列に対して特異性を有し、
排外的修飾ではない表９の少なくとも一つの修飾を含む、組み換えメガヌクレアーゼ。
【請求項４】
野生型Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１１に対し少なくとも８５
％の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
配列番号１３及び配列番号１４から成る群より選ばれるＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼ
認識配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を
有し、
排外的修飾ではない表１１の少なくとも一つの修飾を含む、組み換えメガヌクレアーゼ
。
【請求項５】
野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対し少なくとも８５％
の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５から成る群より選ばれるＩ－ＣＲ
ＥＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分
部位に対して特異性を有し、
（１）位置－１における特異性が、
（Ａ）Ｑ７０、Ｃ７０、Ｌ７０、Ｙ７５、Ｑ７５、Ｈ７５、Ｈ１３９、Ｑ４６及びＨ
４６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＴに変更され；
（Ｂ）Ｙ７５、Ｌ７５、Ｃ７５、Ｙ１３９、Ｃ４６及びＡ４６から成る群より選ばれ
る修飾によって、センス鎖においてＡに変更され；
（Ｃ）Ｋ７０、Ｅ７０、Ｅ７５、Ｅ４６及びＤ４６から成る群より選ばれる修飾によ
って、センス鎖においてＧに変更され、
（Ｄ）Ｈ７５、Ｒ７５、Ｈ４６、Ｋ４６及びＲ４６から成る群より選ばれる修飾によ
って、センス鎖においてＣに変更され、又は、
（Ｅ）Ｇ７０、Ａ７０、Ｓ７０及びＧ４６から成る群より選ばれる修飾によって、セ
ンス鎖において任意の塩基に変更され；
及び／又は
（２）位置－２における特異性が、
（Ａ）Ｑ７０、Ｔ４４、Ａ４４、Ｖ４４、Ｉ４４、Ｌ４４及びＮ４４から成る群より
選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡに変更され；
（Ｂ）Ｅ７０、Ｄ７０、Ｋ４４及びＲ４４から成る群より選ばれる修飾によって、セ
ンス鎖においてＣに変更され；
（Ｃ）Ｈ７０、Ｄ４４及びＥ４４から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＧに変更され；又は、
（Ｄ）Ｃ４４を含む修飾によって、センス鎖においてＡ又はＴに変更され；
及び／又は、
（３）位置－３における特異性が、
（Ａ）Ｑ６８及びＣ２４から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡ
に変更され；
（Ｂ）Ｅ６８、Ｆ６８、Ｋ２４及びＲ２４から成る群より選ばれる修飾によって、セ
ンス鎖においてＣに変更され；
（Ｃ）Ｍ６８、Ｃ６８、Ｌ６８及びＦ６８から成る群より選ばれる修飾によって、セ
ンス鎖においてＴに変更され；
（Ｄ）Ｈ６８を含む修飾によってセンス鎖においてＡ又はＣに変更され；
（Ｅ）Ｙ６８を含む修飾によってセンス鎖においてＣ又はＴに変更され；
（Ｆ）Ｋ６８を含む修飾によってセンス鎖においてＧ又はＴに変更され；
及び／又は、
（４）位置－４における特異性が、
（Ａ）Ｅ７７及びＫ２６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
に変更され；
（Ｂ）Ｅ２６及びＲ７７から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
に変更され；
（Ｃ）Ｓ７７を含む修飾によってセンス鎖においてＣ又はＴに変更され；又は、
（Ｄ）Ｓ２６を含む修飾によってセンス鎖において任意の塩基に変更され；
及び／又は、
（５）位置－５における特異性が、
（Ａ）Ｅ４２を含む修飾によってセンス鎖においてＣに変更され；
（Ｂ）Ｒ４２を含む修飾によってセンス鎖においてＧに変更され；
【請求項６】
野生型Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０に対し少なくとも８５％
の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
配列番号７及び配列番号８から成る群より選ばれるＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼ認識
配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を有し
、
（１）位置－１における特異性が、
（Ａ）Ｋ７５、Ｑ７７、Ａ４９、Ｃ４９及びＫ７９から成る群より選ばれる修飾によ
って、センス鎖においてＡに変更され；
（Ｂ）Ｃ７７、Ｌ７７及びＱ７９から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＴに変更され；
（Ｃ）Ｋ７７、Ｒ７７、Ｅ４９及びＥ７９から成る群より選ばれる修飾によって、セ
ンス鎖においてＧに変更され；
及び／又は、
（２）位置－２における特異性が、
（Ａ）Ｑ７５、Ｋ８１、Ｃ４７、Ｉ４７及びＬ４７から成る群より選ばれる修飾によ
って、センス鎖においてＡに変更され；
（Ｂ）Ｅ７５、Ｄ７５、Ｒ４７、Ｋ４７、Ｋ８１及びＲ８１から成る群より選ばれる
修飾によって、センス鎖においてＣに変更され；
（Ｃ）Ｋ７５、Ｅ４７及びＥ８１から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＧに変更され；
及び／又は、
（３）位置－３における特異性が、
（Ａ）Ｑ７２、Ｃ２６、Ｌ２６、Ｖ２６、Ａ２６及びＩ２６から成る群より選ばれる
修飾によって、センス鎖においてＡに変更され；
（Ｂ）Ｅ７２、Ｙ７２、Ｈ２６、Ｋ２６及びＲ２６から成る群より選ばれる修飾によ
って、センス鎖においてＣに変更され；
（Ｃ）Ｋ７２、Ｙ７２及びＨ２６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＴに変更され；
及び／又は、
（４）位置－４における特異性が、
（Ａ）Ｋ２８、Ｋ８３及びＱ２８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＴに変更され；
（Ｂ）Ｒ８３及びＫ８３から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
に変更され；
（Ｃ）Ｋ２８及びＱ８３から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡ
に変更され；
及び／又は、
（５）位置－５における特異性が、
（Ａ）Ｒ４５及びＥ２８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
に変更され；
（Ｂ）Ｑ２８を含む修飾によってセンス鎖においてＴに変更され；
（Ｃ）Ｒ２８を含む修飾によってセンス鎖においてＣに変更され；
及び／又は、
（６）位置－６における特異性が、
（Ａ）Ｋ４３、Ｖ８５、Ｌ８５及びＱ３０から成る群より選ばれる修飾によって、セ
ンス鎖においてＴに変更され；
（Ｂ）Ｅ４３、Ｅ８５、Ｋ３０及びＲ３０から成る群より選ばれる修飾によって、セ
ンス鎖においてＣに変更され；または、
【請求項７】
野生型Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼと比べ、認識配列に対する特異性が変更された組
み換えメガヌクレアーゼであって、
配列番号９のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの残基３－１８６に対し少なくとも８５％
の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
配列番号１０及び配列番号１１のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼと、少なくとも１塩基
対異なる認識配列に対して特異性を有し、
（１）位置４における特異性が、
（Ａ）Ｋ５０を含む修飾によってセンス鎖においてＡに変更され；
（Ｂ）Ｋ５７、Ｍ５７及びＱ５０から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＴに変更され；
（Ｃ）Ｅ５０、Ｒ５７及びＫ５７から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＧに変更され；及び／又は、
（２）位置５における特異性が、
（Ａ）Ｋ４８、Ｑ１０２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡ
に変更され；
（Ｂ）Ｅ４８、Ｋ１０２及びＲ１０２から成る群より選ばれる修飾によって、センス
鎖においてＧに変更され；
（Ｃ）Ｑ４８、Ｃ１０２、Ｌ１０２及びＶ１０２から成る群より選ばれる修飾によっ
て、センス鎖においてＴに変更され；
及び／又は、
（３）位置６における特異性が、
（Ａ）Ｋ５９を含む修飾によってセンス鎖においてＡに変更され；
（Ｂ）Ｒ５９及びＫ５９から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
に変更され；
（Ｂ）Ｋ８４及びＥ５９から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
に変更され；
及び／又は、
（４）位置７における特異性が、
（Ａ）Ｒ４６、Ｋ４６及びＥ８６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＣに変更され；
（Ｂ）Ｋ８６、Ｒ８６及びＥ４６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＧに変更され；
（Ｃ）Ｃ４６、Ｌ４６及びＶ４６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＡに変更され；
及び／又は、
（５）位置８における特異性が、
（Ａ）Ｅ８８、Ｒ６１及びＨ６１から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＣに変更され；
（Ｂ）Ｋ８８、Ｑ６１及びＨ６１から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＴに変更され；
（Ｃ）Ｋ６１、Ｓ６１、Ｖ６１、Ａ６１及びＬ６１から成る群より選ばれる修飾によ
って、センス鎖においてＡに変更され；
及び／又は、
（６）位置９における特異性が、
（Ａ）Ｃ９８、Ｖ９８及びＬ９８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＡに変更され；
（Ｂ）Ｒ９８及びＫ９８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
に変更され；又は、
（Ｃ）Ｅ９８及びＤ９８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
に変更され；
【請求項８】
野生型Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１１に対し少なくとも８５
％の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
配列番号１３及び配列番号１４から成る群より選ばれるＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼ
認識配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を
有し、
（１）位置－１における特異性が、
（Ａ）Ｃ９２、Ａ９２及びＶ９２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＡに変更され；
（Ｂ）Ｑ１１６及びＱ９２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖において
Ｔに変更され；
（Ｃ）Ｅ１１６及びＥ９２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖において
Ｇに変更され；
及び／又は、
（２）位置－２における特異性が、
（Ａ）Ｑ１１７、Ｃ９０、Ｌ９０及びＶ９０から成る群より選ばれる修飾によって、
センス鎖においてＡに変更され；
（Ｂ）Ｋ１１７、Ｒ１２４、Ｋ１２４、Ｅ１２４、Ｅ９０及びＤ９０から成る群から
選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧに変更され；
（Ｃ）Ｅ１１７、Ｄ１１７、Ｒ１７４、Ｋ１２４、Ｋ９０及びＫ６８から成る群から
選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣに変更され；
及び／又は、
（３）位置－３における特異性が、
（Ａ）Ｃ７０、Ｖ７０、Ｔ７０、Ｌ７０及びＫ７０から成る群より選ばれる修飾によ
って、センス鎖においてＡに変更され；
（Ｂ）Ｑ７０を含む修飾によってセンス鎖においてＴに変更され；
（Ｂ）Ｋ７０を含む修飾によってセンス鎖においてＣに変更され；
及び／又は、
（４）位置－４における特異性が、
（Ａ）Ｅ１２６、Ｄ１２６、Ｒ８８、Ｋ８８及びＫ７２から成る群より選ばれる修飾
によって、センス鎖においてＣに変更され；
（Ｂ）Ｋ１２６、Ｌ１２６及びＱ８８から成る群より選ばれる修飾によって、センス
鎖においてＴに変更され；
（Ｃ）Ｑ１２６、Ｎ１２６、Ｋ８８、Ｌ８８、Ｃ７２、Ｌ７２及びＶ７２から成る群
より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡに変更され；
及び／又は、
（５）位置－５における特異性が、
（Ａ）Ｅ７４、Ｋ１２８、Ｒ１２８及びＥ１２８から成る群より選ばれる修飾によっ
て、センス鎖においてＧに変更され；
（Ｂ）Ｃ１２８、Ｌ１２８、Ｖ１２８及びＴ１２８から成る群から選ばれる修飾によ
って、センス鎖においてＴに変更され；又は、
（Ｃ）Ｃ７４、Ｌ７４、Ｖ７４及びＴ７４から成る群より選ばれる修飾によって、セ
ンス鎖においてＡに変更され；
及び／又は、
（６）位置－６における特異性が、
（Ａ）Ｋ８６、Ｃ８６及びＬ８６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
おいてＴに変更され；
（Ｂ）Ｄ８６、Ｅ８６、Ｒ８４及びＫ８４から成る群より選ばれる修飾によって、セ
ンス鎖においてＣに変更され；又は、
【請求項９】
野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼと比べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度が変更
された組み換えメガヌクレアーゼであって、
配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対して少なくとも８５
％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和度が、
（Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲによるＥ８０、Ｄ１３７、Ｉ８１、Ｌ１１２、Ｐ
２９、Ｖ６４又はＹ６６の置換；
又は、
（Ｂ）Ｋ又はＲによるＴ４６、Ｔ１４０又はＴ１４３の置換、
から成る群より選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって上昇する
ことを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
【請求項１０】
野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼと比べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度が変更
された組み換えメガヌクレアーゼであって、
配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対して少なくとも８５
％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和度が、
（Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥによるＫ３４、Ｋ４８、Ｒ５１、Ｋ８２、Ｋ１１
６、またはＫ１３９の置換；
又は、
（Ｂ）Ｄ又はＥによるＩ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４、Ｙ６６、Ｔ４６、Ｔ１４０
又はＴ１４３の置換から成る群より選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾
によって低下することを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および組み換え核酸工学の分野に関する。特に、本発明は、ＤＮ
Ａ認識配列特異性及び／又は親和度が変更された、合理的に設計された、非天然のメガヌ
クレアーゼに関する。さらに、本発明は、そのようなメガヌクレアーゼの生産法、および
、そのようなメガヌクレアーゼによる、組み換え核酸および生物の生産法に関する。
続きを表示（約 5,000 文字）【背景技術】
【０００２】
（関連出願）本出願は、２００５年１０月１８日出願の米国特許仮出願第６０／７２７
，５１２号の優先権の利益を主張する。なお、この引用出願の全開示を、参照することに
より本出願に含める。
【０００３】
（政府援助）本発明は、アメリカ合衆国国立衛生研究所、国立医科学研究所からの研究補
助金２Ｒ０１－ＧＭ－０４９８７１２、５Ｆ３２－ＧＭ０７２３２２、および５ＤＰ１
ＯＤ０００１２２によって一部援助された。したがって、米国政府も、本発明において
若干の権利を保有する場合がある。
【０００４】
ゲノム工学は、あるゲノムの内部に、特定の遺伝子配列を、挿入し、欠失し、置換し、
および、その他のやり方で操作することを可能とする能力を要求するが、多くの治療的お
よび生物工学的応用を有する。ゲノム修飾のための効果的手段の開発は、これまでずっと
、遺伝子治療、農工学、および合成生物学における主要目標となっている（ＰＯＲＴＥＵ
ＳＥＴＡＬ．（２００５），ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．２３；９６７－７３；
ＴＺＦＩＲＡＥＴＡＬ．（２００５），ＴＲＥＮＤＳＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．２３
：５６７－９；ＭＣＤＡＮＩＥＬＥＴＡＬ．（２００５），ＣＵＲＲ．ＯＰＩＮ．Ｂ
ＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．１６：４７６－８３）。ＤＮＡ配列を挿入又は修飾するための一般
的方法は、ゲノム標的に対して相同な配列によって側接される、トランスジェニックＤＮ
Ａ配列を導入すること、および、所望の相同組み換え事象を選択またはスクリーニングす
ることを含む。トランスジェニックＤＮＡによる組み換えはめったに起こらないが、標的
部位のゲノムＤＮＡにおける２本鎖切断によって刺激することが可能である。従来から、
ＤＮＡ２本鎖切断部を作るために、例えば、放射線照射および化学的処理を含めた数多く
の方法が用いられている。これらの方法は、効率的に組み換えを刺激することが可能では
あるけれども、二本鎖切断部は、ゲノムの中にランダムに挿入され、それらは、突然変異
誘発性および毒性が高い可能性がある。現在、染色体バックグランドにある特定の部位に
対し遺伝子修飾を照準することはできていないため、思い通りのゲノム加工に対する大き
な障害となっている。
【０００５】
この目標を達成するための一つの方法は、ゲノム内の単一部位にしか存在しないほど十
分に大きい配列に対し特異性を持つヌクレアーゼを用いて、標的配座に二本鎖切断部を設
けてその部位における相同組み換えを刺激することである（例えば、ＰＯＲＴＥＵＳＥ
ＴＡＬ．（２００５），ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．２３：９６７－７３を参照）
。この戦略の有効性は、ＦＯＫＩ制限酵素の、加工されたジンクフィンガーＤＮＡ－結合
ドメインと、非特異的ヌクレアーゼドメインとの間のキメラ融合を用いて、各種の生物体
において明らかにされている（ＰＯＲＴＥＵＳ（２００６），ＭＯＬＴＨＥＲ１３：
４３８－４６；ＷＲＩＧＨＴＥＴＡＬ．（２００５），ＰＬＡＮＴＪ．４４：６９
３－７０５；ＵＲＮＯＶＥＴＡＬ．（２００５），ＮＡＴＵＲＥ４３５：６４６－
５１）。これらの人工的ジンクフィンガーヌクレアーゼは、部位特異的組み換えを刺激す
るけれども、これらのヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの調整低調に由来する、非
特異的な、残留切断活性を保持するので、不要の部位を切断することがしばしばある（Ｓ
ＭＩＴＨＥＴＡＬ．（２０００），ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＲＥＳ．２８：３
３６１－９）。これらの不要な切断は、処置生物体において、突然変異および毒性を引き
起こす可能性がある（ＰＯＲＴＥＵＳＥＴＡＬ．（２００５），ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥ
ＣＨＮＯＬ．２３：９６７－７３）。
【０００６】
植物および菌類のゲノムの中に一般的に認められる、１５－４０塩基対切断部位を認識
する、１群の天然ヌクレアーゼは、比較的毒性の低い、ゲノム加工代替品を提供する可能
性がある。このような「メガヌクレアーゼ」または「ホーミング・エンドヌクレアーゼ」
は、多くの場合、寄生的ＤＮＡ要素、例えば、グループ１自己スプライシングイントロン
およびインテインとコンタクトされる。これらのヌクレアーゼは、自然状態で、宿主ゲノ
ムの特異的位置における相同的組み換えまたは遺伝子挿入を促進する。これを、細胞のＤ
ＮＡ－修復機構を招集する、染色体において二本鎖切断を生産することによって行う（Ｓ
ＴＯＤＤＡＲＤ（２００６），ＲＥＶ．ＢＩＯＰＨＹＳ．３８：４９－９５）。一般に、
メガヌクレアーゼは、４つのファミリーに分けられる。すなわち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧフ
ァミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、ＨＩＳ－ＣＹＳボックスファミリー、およびＨＮ
Ｈファミリーである。これらのファミリーは、触媒活性および認識配列に影響を及ぼす、
構造的モチーフによって特徴づけられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメン
バーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ保存モチーフの、１または２コピーを持つことによって特徴
づけられる（ＣＨＥＶＡＬＩＥＲＥＴＡＬ．（２００１），ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩ
ＤＳＲＥＳ．２９（１８）：３７５７－３７７４を参照）。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチー
フの単一コピーを持つＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、ホモダイマーを形成する
が、一方、２コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを持つメンバーは、モノマーであるこ
とが判明した。同様に、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリーメンバーは、７０－１００残基長のＧ
ＩＹ－ＹＩＧモジュールを持ち、その内二つは活性のために必要な、四つの不変残基を持
つ、４から５個の保存配列モチーフを含む（ＶＡＮＲＯＥＹＥＴＡＬ．（２００２
），ＮＡＴＵＲＥＳＴＲＵＣＴ．ＢＩＯＬ．９：８０６－８１１を参照）。ＨＩＳ－Ｃ
ＹＳボックス・メガヌクレアーゼは、数百のアミノ酸残基を含む領域に分散する、高度に
保存された、ヒスチジンおよびシステインの連続列によって特徴づけられる（ＣＨＥＶＡ
ＬＩＥＲＥＴＡＬ．（２００１），ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＲＥＳ．２９（１
８）：３７５７－３７７４を参照）。ＮＨＮファミリーの場合は、そのメンバーは、２対
の、アスパラギン残基によって囲まれる保存ヒスチジンを含むモチーフによって定義され
る（ＣＨＥＶＡＬＩＥＲＥＴＡＬ．（２００１），ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＲ
ＥＳ．２９（１８）：３７５７－３７７４を参照）。メガヌクレアーゼのこの４ファミリ
ーは、構造保存部位に関してＤＮＡ認識配列の特異性及び触媒活性が互いに大きく異なっ
ている。
【０００７】
主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーから得られる、天然のメガヌクレアーゼは、これま
で、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳類細胞及びマウスにおいて部位特異的なゲノム
修飾に有効に使用されているが、この方法は、このメガヌクレアーゼ認識配列を保存する
相同配列か（ＭＯＮＮＡＴＥＴＡＬ．（１９９９），ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹ
Ｓ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．２５５：８８－９３）又は認識配列を導入したあらかじめ加
工されたゲノム（ＲＯＵＥＴＥＴＡＬ．（１９９４），ＭＯＬ．ＣＥＬＬＢＩＯＬ
．１４：８０９６－１０６；ＣＨＩＬＴＯＮＥＴＡＬ．（２００３），ＰＬＡＮＴ
ＰＨＹＳＩＯＬ．１３３：９５６－６５；ＰＵＣＨＴＡＥＴＡＬ．（１９９６），Ｐ
ＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ９３：５０５５－６０；ＲＯＮＧＥＴ
ＡＬ．（２００２），ＧＥＮＥＳＤＥＶ．１６：１５６８－８１；ＧＯＵＢＬＥＥ
ＴＡＬ．（２００６），Ｊ．ＧＥＮＥＭＥＤ．８（５）：６１６－６２２）の修飾に
限定される。
【０００８】
ヌクレアーゼ刺激による遺伝子修飾の体系的実施は、ゲノムの既存部位に対する標的Ｄ
ＮＡ中断部に向けて照準させた特異性を持つ加工酵素の使用が必要となる。したがって、
医学的又は生物工学的関連部位において遺伝子修飾を促進するようにメガヌクレアーゼを
適応させることについては大きな関心が寄せられている（ＰＯＲＴＥＵＳＥＴＡＬ．
（２００５），ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．２３：９６７－７３；ＳＵＳＳＭＡＮ
ＥＴＡＬ．（２００４），Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．３４２：３１－４１；ＥＰＩＮＡＴ
ＥＴＡＬ．（２００３），ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＲＥＳ．３１：２９５２－
６２）。
【０００９】
ＣＨＬＡＭＹＤＯＭＯＮＡＳＲＥＩＮＨＡＲＤＴＩＩから得られたメガヌクレアーゼＩ
－ＣＲＥＩは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーの一員であり、葉緑体染色体の中の２２塩
基対認識配列を認識・切断し、かつ、メガヌクレアーゼ再設計の好個の標的となっている
。この野生型酵素は、各モノマーが、全体認識配列における９塩基対に対して直接接触す
る、ホモダイマーである。この認識配列の単一位置において（ＳＵＳＳＭＡＮＥＴＡ
Ｌ．（２００４），Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．３４２：３１－４１；ＣＨＡＭＥＳＥＴ
ＡＬ．（２００５），ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＲＥＳ．３３：Ｅ１７８；ＳＥＬＩ
ＧＭＡＮＥＴＡＬ．（２００２），ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＲＥＳ．３０：３
８７０－９）、あるいは、比較的最近では、認識配列の中の３位置において（ＡＲＲＮＯ
ＵＬＤＥＴＡＬ．（２００６），Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．３５５：４４３－５８）、
塩基選択性を変えるＩ－ＣＲＥＩにおける突然変異を特定するために、遺伝子選択技術が
用いられている。Ｉ－ＣＲＥＩタンパク－ＤＮＡインターフェイスは、ＤＮＡ塩基に直接
接触する９個のアミノ酸と、修飾されたインターフェイスにおいて接触を形成する可能性
のある、少なくともさらに５個の残基を含む。このインターフェイスのサイズは、切断部
位を大きく変更された酵素を選択するために構築された配列ライブラリーにおいても十分
に抽出されることがほとんどないと思われるほど複雑な組み合わせを提示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ゲノムの正確な修飾を促進するヌクレアーゼについては、依然として需要がある。さら
に、特定の遺伝子座位における遺伝子配列の操作を可能とする、あらかじめ指定された、
合理的に設計された認識配列を有するヌクレアーゼを生成する技術、および、正確な配列
修飾を持つ生物体を遺伝学的に加工するために、そのようなヌクレアーゼを利用する技術
に対しては、依然として需要がある。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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