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公開番号2025175149
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-28
出願番号2025158193,2023173277
出願日2025-09-24,2013-12-16
発明の名称RNA誘導性ヒトゲノム改変
出願人プレジデントアンドフェローズオブハーバードカレッジ
代理人個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20251120BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】真核細胞を改変する方法の提供。
【解決手段】真核細胞のゲノムDNAに相補的なRNAをコードする核酸を真核細胞にトランスフェクトすること、および前記RNAと相互作用して前記ゲノムDNAを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすることを含み、前記細胞が前記RNAおよび前記酵素を発現し、前記RNAが相補的ゲノムDNAに結合し、前記酵素がゲノムDNAを部位特異的に切断する、真核細胞を改変する方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
本開示に実質的に開示された発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本願は、２０１３年３月１３日に出願された米国特許仮出願第６１／７７９，１６９号および２０１２年１２月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／７３８，３５５号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のため、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 4,300 文字）【０００２】
政府利益に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＰ５０ＨＧ００５５５０の下、政府の援助により成されたものである。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したｃｒＲＮＡに依存して、侵入するウイルスおよびプラスミドＤＮＡ中に存在する相補的配列を分解する（参照文献１～３）。近年、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのインビトロ再構築により、通常はトランスにコードされるｔｒａｃｒＲＮＡと融合したｃｒＲＮＡが、Ｃａｓ９タンパク質に該ｃｒＲＮＡにマッチする標的ＤＮＡ配列を配列特異的に切断させるのに十分であることが実証された（参照文献４）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は文献を数字で参照し、それらは本開示の最後に列挙されている。数字に対応する文献は、完全に引用された場合と同様に、数字に対応する補足文献として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
本開示のある態様によれば、ゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡおよび該ＲＮＡと相互作用する酵素を含む二成分系が真核細胞にトランスフェクトされる。ＲＮＡおよび酵素は細胞によって発現される。次いで、ＲＮＡ／酵素複合体のＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合する。次いで、酵素が前記ゲノムＤＮＡの切断などの機能を果たす。ＲＮＡは、約１０ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチドを含む。ＲＮＡは、約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドを含む。ある態様によれば、酵素は、部位特異的に任意の所望の機能を果たすことができ、そのために酵素が改変されている。ある態様によれば、真核細胞は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である。ある態様によれば、酵素は、ＲＮＡ配列の標的とされたゲノム配列を切断し（参照文献（４～６）参照）、これによりゲノム改変された真核細胞が作り出される。
【０００６】
ある態様によれば、本開示は、ゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を細胞のゲノム中に含めること、およびゲノムＤＮＡ上で所望の機能を果たす酵素をコードする核酸を細胞のゲノム中に含めることにより、ヒト細胞を遺伝子改変する方法を提供する。ある態様によれば、ＲＮＡおよび酵素が発現される。ある態様によれば、ＲＮＡは相補的ゲノムＤＮＡとハイブリダイズする。ある態様によれば、ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡとハイブリダイズすると、酵素が活性化されて、切断などの所望の機能を部位特異的が果たされる。ある態様によれば、ＲＮＡおよび酵素は、細菌ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネントである。
【０００７】
ある態様によれば、真核細胞のゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を真核細胞にトランスフェクトすること、および前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすることを含み、前記細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、真核細胞を改変する方法が提供される。ある態様によれば、酵素はＣａｓ９、改変Ｃａｓ９、またはＣａｓ９のホモログである。ある態様によれば、真核細胞は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である。ある態様によれば、ＲＮＡは約１０ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチドを含む。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドを含む。
【０００８】
ある態様によれば、真核細胞のゲノムＤＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸をヒト細胞にトランスフェクトすること、および前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記ヒト細胞にトランスフェクトすることを含み、前記ヒト細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、ヒト細胞を改変する方法が提供される。ある態様によれば、酵素はＣａｓ９、改変Ｃａｓ９、またはＣａｓ９のホモログである。ある態様によれば、ＲＮＡは約１０ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチドを含む。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドを含む。
【０００９】
ある態様によれば、真核細胞のゲノムＤＮＡ上の異なる部位に相補的なＲＮＡをコードする複数の核酸を真核細胞にトランスフェクトすること、および前記ＲＮＡと相互作用して前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する酵素をコードする核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすることを含み、前記細胞が前記ＲＮＡおよび前記酵素を発現し、前記ＲＮＡが相補的ゲノムＤＮＡに結合し、前記酵素が前記ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する、複数のゲノムＤＮＡ部位で真核細胞を改変する方法が提供される。ある態様によれば、酵素はＣａｓ９である。ある態様によれば、真核細胞は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である。ある態様によれば、ＲＮＡは約１０ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチドを含む。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
改変ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたヒト細胞におけるゲノム編集を示す図である。
改変ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたヒト細胞におけるゲノム編集を示す図である。
図１Ｃは、改変ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたヒト細胞におけるゲノム編集を示す図である。
図１Ｃは、改変ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたヒト細胞におけるゲノム編集を示す図である。
複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。
図２Ｂは、複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。
図２Ｂは、複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。
図２Ｂは、複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。
複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。
複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。
複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。
複数の細胞型における、もともと存在するＡＡＶＳ１遺伝子座のＲＮＡ誘導性ゲノム編集を示す図である。
図３Ａは、ｃａｓ９遺伝子挿入断片の発現フォーマットおよび完全配列を示す図である。
図３Ａは、ｃａｓ９遺伝子挿入断片の発現フォーマットおよび完全配列を示す図である。
ガイドＲＮＡのＵ６プロモーターに基づく発現スキーム、およびＲＮＡ転写産物の予想二次構造を示す図である。
使用した７種のｇＲＮＡを示す図である。
修復ＤＮＡドナー、Ｃａｓ９タンパク質、およびｇＲＮＡの全ての可能な組み合わせの、９３ＴにおいてＨＲを成功させる能力についての試験を示す図である。
ｇＲＮＡおよびＧａｓ９を介したゲノム編集の分析を示す図である。
ｇＲＮＡおよびＧａｓ９を介したゲノム編集の分析を示す図である。
別個のＧＦＰレポーターコンストラクトをそれぞれ有する３種の２９３Ｔ安定発現細胞株を示す図である。
別個のＧＦＰレポーターコンストラクトをそれぞれ有する３種の２９３Ｔ安定発現細胞株を示す図である。
２９３Ｔにおいて図１Ｂに記載のレポーターの隣接ＧＦＰ配列を標的化する２種の新たなｇＲＮＡを示す図である。
別個のＧＦＰレポーターコンストラクトをそれぞれ有する２種の２９３Ｔ安定発現細胞株を示す図である。
別個のＧＦＰレポーターコンストラクトをそれぞれ有する２種の２９３Ｔ安定発現細胞株を示す図である。
ヒトｉＰＳ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。
ヒトｉＰＳ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。
ヒトｉＰＳ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。
Ｋ５６２細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。
Ｋ５６２細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。
２９３Ｔ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。
２９３Ｔ細胞におけるＲＮＡ誘導性ＮＨＥＪを示す図である。
ｄｓＤＮＡドナーまたは短鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれかを用いた内在性ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＨＲを示す図である。
ｄｓＤＮＡドナーまたは短鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれかを用いた内在性ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＨＲを示す図である。
ｄｓＤＮＡドナーまたは短鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれかを用いた内在性ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＨＲを示す図である。
図１３Ａは、ヒトゲノム中の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの多重合成、回収、およびＵ６発現ベクターのクローニングの方法を示す図である。
図１３Ａは、ヒトゲノム中の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの多重合成、回収、およびＵ６発現ベクターのクローニングの方法を示す図である。
ヒトゲノム中の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡの多重合成、回収、およびＵ６発現ベクターのクローニングの方法を示す図である。
ＣＲＩＳＰＲを介したＲＮＡ誘導性転写活性化を示す図である。
ＣＲＩＳＰＲを介したＲＮＡ誘導性転写活性化を示す図である。
ＣＲＩＳＰＲを介したＲＮＡ誘導性転写活性化を示す図である。
ＣＲＩＳＰＲを介したＲＮＡ誘導性転写活性化を示す図である。
ｇＲＮＡ配列の柔軟性を示す図である。
ｇＲＮＡ配列の柔軟性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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