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公開番号2025172045
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-20
出願番号2025078800
出願日2025-05-09
発明の名称アルカリホスファターゼ組成物
出願人キッコーマン株式会社
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 9/16 20060101AFI20251113BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】アルカリホスファターゼ組成物を提供する。
【解決手段】糖鎖を有するアルカリホスファターゼと硫酸塩を含む組成物。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
糖鎖を有するアルカリホスファターゼと硫酸塩を含む組成物（ただし、ヒト由来アルカリホスファターゼを除く）。
続きを表示（約 1,600 文字）【請求項２】
硫酸塩が、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ
4
）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ
4
）、硫酸ナトリウム（Ｎａ
2
ＳＯ
4
）又は硫酸アンモニウム（（ＮＨ
4
）
2
ＳＯ
4
）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物中の硫酸塩の濃度が、０．１～５００ｍＭである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物中のアルカリホスファターゼの濃度が、０．１８～５２．５ｍｇ／ｍＬである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
組成物中のアルカリホスファターゼの濃度が、０．１８～５２．５ｍｇ／ｍＬであり、かつ、組成物中の硫酸塩の濃度が、０．１～５００ｍＭの量である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
組成物中のアルカリホスファターゼの比活性が、５８００～８８００Ｕ/ｍｇである、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
糖鎖を有するアルカリホスファターゼが、真核生物組換え発現アルカリホスファターゼである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
真核生物が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属又はサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
真核生物が、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ：アスペルギルス・ソーヤ）、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ（Ａｈｌｂｕｒｇ）Ｃｏｈｎ：アスペルギルス・オリゼー）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ：アスペルギルス・リュウキュウエンシス）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｕｓａｍｉｉ）、若しくはアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓａｉｔｏｉ）のいずれかである、又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、又はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂａｙａｎｕｓｖａｒ．ｕｖａｒｕｍ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｍｉｋａｔａｅ）、サッカロマイセス・パラドクサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロマイセス・アルボリコラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓａｒｂｏｒｉｃｏｌａ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロマイセス・クドリアフゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、若しくはサッカロマイセス・ユーバヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｅｕｂａｙａｎｕｓ）のいずれかである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
糖鎖を有するアルカリホスファターゼを含む組成物（ただし、ヒト由来アルカリホスファターゼを除く）の製造方法であって、
糖鎖を有するアルカリホスファターゼを調製する工程、
前記アルカリホスファターゼと硫酸塩を混合する工程
を含む、方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリホスファターゼ組成物に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略称する場合がある。）は、イムノアッセイのマーカーとして広く利用されている。
【０００３】
ＡＬＰは、ウシ腸管からの抽出によって製造されるＡＬＰが用いられている。ウシ由来のＡＬＰは、比活性が高く、標識酵素として長年使用されているが、哺乳動物由来であるため、個体差による品質の大きなブレ等があることに加え、近年の動物愛護意識の高まりを受け、代替となる動物由来でないものへの切り替えが検討される。また、ウシ由来のＡＬＰには、複数存在するＡＬＰアイソフォームによる活性のばらつき等が存在する。このため、抽出や精製を経て製造されている市販のＡＬＰ製品であっても、複数存在するアイソフォームを含む混合物であることが実情であり、酵素製品としての均一性に劣るという問題を有している。
【０００４】
ＡＬＰを酵母やアスペルギルス属形質転換体等で発現させる試みも行われている（特許文献１及び２）。
【０００５】
ウシ由来のＡＬＰは、二量体の膜由来糖タンパク質であり、酵素活性を発揮するためには、亜鉛、マグネシウム又はカルシウムの二価イオンが必要であることが知られている（非特許文献１）。
これまで、大腸菌や無細胞発現系で得られた、糖鎖付加のない仔牛腸由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）において、用いる金属イオンの対イオンによって、比活性や安定化に影響を与えることが確認されている（特許文献３～５）。例えば、特許文献３では、終濃度が１Ｍとなるように硫酸アンモニウム溶液を添加することで、ＣＩＡＰが、高い活性を示すことが示されている。また、硫酸塩を用いることで、原核生物を宿主若しくは無細胞発現系で生産させたＣＩＡＰの活性を向上させることが示されている（特許文献４又は５）。
【０００６】
特許文献６には、ＡＬＰ活性の測定において基質として用いるｐ－ニトロフェニルリン酸の加水分解が抑制されるＡＬＰ活性測定試薬が開示されており、具体的に、ヒトＡＬＰの反応促進剤として、マグネシウム塩が好ましいこと、その一例として、酢酸塩、アスパラギン酸塩、塩化物、硫酸塩等が開示されている。また、特許文献７には、バチルス属に属する細菌から、熱安定性及び比活性が高いアルカリホスファターゼを見出したことが開示されており、その中でバチルス属細菌由来のＡＬＰの不活性化を防ぐことを目的に、金属塩を添加すること、使用できる金属塩の一例として０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウムを使用することができることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
特開２００８－００５７３４号公報
国際公開第２０１９／０６９９７７号
国際公開第２０２２－１９６５３８号
特開２０２３－１３３２３６号公報
特公平８－０２４５７２号公報
特開平１１－１８７８９７号公報
特許第４０３５７３８号公報
【非特許文献】
【０００８】
Isozymes of bovine intestinal alkaline phosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 1985, Vol. 260, No. 20, 11190-11193.
【発明の概要】
【０００９】
本願発明が解決しようとする課題は、それに含まれるＡＬＰが高い比活性を示し、また、高塩濃度条件下でのＡＬＰ活性のばらつきが抑制されるＡＬＰを含む組成物を提供することである。
【００１０】
そこで、本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究を重ねた結果、糖鎖を有するＡＬＰと硫酸塩を組み合わせた組成物とすることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
（【００１１】以降は省略されています）

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