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公開番号2025167011
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-07
出願番号2024071261
出願日2024-04-25
発明の名称薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびPseudomonas属細菌の検出方法およびその用途
出願人学校法人関西医科大学
代理人弁理士法人レクシード・テック
主分類C12Q 1/6851 20180101AFI20251030BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】迅速な薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびPseudomonas属細菌を検出可能な検出方法、細菌に対する抗菌薬を選定するための指標の提供方法、およびこれらの方法に使用可能なプライマーセットを提供する。
【解決手段】本開示の薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびPseudomonas属細菌の検出方法は、対象の試料について、下記(1)～(3)および(4)の標的遺伝子を核酸増幅し、前記試料における薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびPseudomonas属細菌を検出する工程を含む:(1)mecA遺伝子;(2)黄色ブドウ球菌のspa遺伝子;(3)ブドウ球菌属細菌のtuf遺伝子および/またはrpoB遺伝子;(4)Pseudomonas属細菌の16S rRNA遺伝子。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
対象の試料について、下記（１）～（３）および（４）の標的遺伝子を核酸増幅し、前記試料における薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌および緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌を検出する工程を含む、薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の検出方法：
（１）ｍｅｃＡ遺伝子；
（２）黄色ブドウ球菌のｓｐａ遺伝子；
（３）ブドウ球菌属細菌のｔｕｆ遺伝子および／またはｒｐｏＢ遺伝子；
（４）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子。
続きを表示（約 4,200 文字）【請求項２】
前記核酸増幅において、下記（１）～（３）、および／または、（４）の領域を核酸増幅する、請求項１に記載の検出方法。
（１）前記ｍｅｃＡ遺伝子における配列番号１からなる塩基配列を含む領域；
（２）前記ｓｐａ遺伝子における配列番号２からなる塩基配列を含む領域；
（３）前記ｔｕｆ遺伝子における配列番号３からなる塩基配列を含む領域、および／または、前記ｒｐｏＢ遺伝子における配列番号４からなる塩基配列を含む領域；
（４）前記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子における配列番号５からなる塩基配列を含む領域。
【請求項３】
前記核酸増幅において、下記（Ａ１）～（Ｃ１）、および／または、（Ｄ１）のプライマーセットを用いて、前記標的遺伝子を核酸増幅する、請求項１または２に記載の検出方法。
（Ａ１）前記ｍｅｃＡ遺伝子における配列番号１からなる塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット；
（Ｂ１）前記ｓｐａ遺伝子における配列番号２からなる塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット；
（Ｃ１）前記ｔｕｆ遺伝子における配列番号３からなる塩基配列を含む領域、および／または、前記ｒｐｏＢ遺伝子における配列番号４からなる塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット；
（Ｄ１）前記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子における配列番号５からなる塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット。
【請求項４】
前記核酸増幅において、下記（Ａ２）～（Ｃ２）、および／または、（Ｄ２）のプライマーセットを用いて、前記標的遺伝子を核酸増幅する、請求項１または２にに記載の検出方法：
（Ａ２）プライマーセット：
配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット；
（Ｂ２）プライマーセット：
配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット；
（Ｃ２）プライマーセット：
配列番号１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット、および／または、
配列番号１２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット；
（Ｄ２）プライマーセット：
配列番号１４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット。
【請求項５】
前記核酸増幅において、下記（Ａ３）～（Ｃ３）、および／または、（Ｄ３）のプライマーセットを用いて、前記標的遺伝子を核酸増幅する、請求項１または２にに記載の検出方法：
（Ａ３）プライマーセット：
配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット；
（Ｂ３）プライマーセット：
配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１８の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット；
（Ｃ３）プライマーセット：
配列番号１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット、および／または、
配列番号１２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット；
（Ｄ３）プライマーセット：
配列番号１４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット。
【請求項６】
前記核酸増幅において、下記（Ａ４）～（Ｅ４）、および／または、（Ｆ４）のプライマーセットを用いて、前記標的遺伝子を核酸増幅する、請求項１または２にに記載の検出方法：
（Ａ４）プライマーセット：
配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット；
（Ｂ４）プライマーセット：
配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１８の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２８の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット；
（Ｃ４）プライマーセット：
配列番号１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２９の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット、および／または、
配列番号１２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号３０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号３１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット；
（Ｄ４）プライマーセット：
配列番号１４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号２５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号３２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプライマーと、
を含むプライマーセット。
【請求項７】
前記検出工程は、前記対象の試料について、前記（１）～（３）および（４）の標的遺伝子を核酸増幅して、前記標的遺伝子を検出する工程と、
下記表６の基準に基づき、薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の存在を評価する工程を含む、請求項１または２にに記載の検出方法。
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2025167011000017.jpg
141
170
【請求項８】
前記（３）の標的遺伝子は、ブドウ球菌属細菌のｔｕｆ遺伝子およびｒｐｏＢ遺伝子であり、
下記表７の基準に基づき、薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌および緑膿菌を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の存在を評価する工程を含む、請求項１または２にに記載の検出方法。
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2025167011000018.jpg
132
170
【請求項９】
前記核酸増幅は、ＬＡＭＰ法による核酸増幅である、請求項１または２にに検出方法。
【請求項１０】
対象の試料について、下記（１）～（３）および（４）の標的遺伝子を核酸増幅し、前記試料に含まれる細菌に対する候補抗菌薬を提示する工程を含む、細菌に対する抗菌薬を選定するための指標の提供方法：
（１）ｍｅｃＡ遺伝子；
（２）黄色ブドウ球菌のｓｐａ遺伝子；
（３）ブドウ球菌属細菌のｔｕｆ遺伝子、および／または、ｒｐｏＢ遺伝子；
（４）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の検出方法およびその用途に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
細菌の感染症に対しては、抗菌薬が汎用されている。しかしながら、前記抗菌薬の汎用により、薬剤耐性菌が生じ、問題となっている（非特許文献１）。このため、前記薬剤耐性菌の発生を抑制するために、広域抗菌薬およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）薬の使用を最小限にすることが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
ＷＨＯ、“薬剤耐性（AMR）対策アクションプラン”、令和５年４月７日，国際的に脅威となる感染症対策の強化のための国際連携等関係閣僚会議
山口哲央著，“AMR対策アクションプラン時代の感染症診療・対策-わが国におけるCA-MRSAの疫学情報と臨床像-”日本化学療法学会雑誌，Vol.67,No.5，(2019),567-576
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
感染症の原因菌の特定について、一般的に、患部から細菌を回収し、培養検査により原因菌の特定と併せて薬剤感受性および耐性が評価されている。しかしながら、前記培養検査による原因菌の特定および薬剤感受性／耐性の特定には、数日を要する。このため、原因菌の特定および薬剤感受性／耐性の特定の迅速化が望まれている。
【０００５】
そこで、本開示は、迅速に、薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌を検出可能な検出方法、細菌に対する抗菌薬を選定するための指標の提供方法、およびこれらの方法に使用可能なプライマーセットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本開示の薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の検出方法（以下、「検出方法」ともいう。）は、対象の試料について、下記（１）～（３）および（４）の標的遺伝子を核酸増幅し、前記試料における薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌を検出する工程を含む：
（１）ｍｅｃＡ遺伝子；
（２）黄色ブドウ球菌のｓｐａ遺伝子；
（３）ブドウ球菌属細菌のｔｕｆ遺伝子および／またはｒｐｏＢ遺伝子；
（４）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子。
【０００７】
本開示の細菌に対する抗菌薬を選定するための指標の提供方法（以下、「提供方法」ともいう。）は、対象の試料について、下記（１）～（３）および（４）の標的遺伝子を核酸増幅し、前記試料に含まれる細菌に対する候補抗菌薬を提示する工程を含む：
（１）ｍｅｃＡ遺伝子；
（２）黄色ブドウ球菌のｓｐａ遺伝子；
（３）ブドウ球菌属細菌のｔｕｆ遺伝子、および／または、ｒｐｏＢ遺伝子；
（４）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子。
【０００８】
本開示の薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の検出に用いるためのプライマーセット（以下、「プライマーセット」ともいう。）は、下記（１）～（３）および（４）の標的遺伝子を核酸増幅可能なプライマーセットを含む：
（１）ｍｅｃＡ遺伝子；
（２）黄色ブドウ球菌のｓｐａ遺伝子；
（３）ブドウ球菌属細菌のｔｕｆ遺伝子、および／または、ｒｐｏＢ遺伝子；
（４）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子
【０００９】
本開示の薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の検出キットは、本開示のプライマーセットと、核酸増幅試薬とを含む。
【発明の効果】
【００１０】
本開示は、迅速な薬剤耐性菌、ブドウ球菌属細菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌を検出可能な検出方法、細菌に対する抗菌薬を選定するための指標の提供方法、およびこれらの方法に使用可能なプライマーセットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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