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公開番号2025161582
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-24
出願番号2024064894
出願日2024-04-12
発明の名称ホルマリン固定液からの核酸抽出方法
出願人学校法人関西医科大学
代理人弁理士法人京都七条特許事務所,個人,個人
主分類C12Q 1/6806 20180101AFI20251017BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】サンプル浸漬後のホルマリンから核酸を抽出する方法の提供。
【解決手段】核酸の抽出方法であって、(1)サンプル浸漬後のホルマリンに、ホルマリン中和剤を添加する工程、及び(2)工程(1)で得られた混合物から核酸を抽出する工程を含む、方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
核酸の抽出方法であって、以下：
（１）サンプル浸漬後のホルマリンに、ホルマリン中和剤を添加する工程、及び
（２）工程（１）で得られた混合物から核酸を抽出する工程
を含む、方法。
続きを表示（約 580 文字）【請求項２】
前記ホルマリン中和剤が、過酸化水素及び水中で過酸化水素を生成する過酸化物からなる群から選択される１つ以上の化合物、又は尿素及び酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ホルマリン中和剤が、過酸化水素及び水中で過酸化水素を生成する過酸化物からなる群から選択される１つ以上の化合物を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の化合物が過酸化水素である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ホルマリン中和剤が、尿素及び酸を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記酸が、クエン酸である、請求項２又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記ホルマリン中和剤が、さらに塩化カルシウムを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
工程（１）において、さらに界面活性剤を添加する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記界面活性剤の少なくとも１つがイオン性界面活性剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記イオン性界面活性剤の少なくとも１つが陰イオン性界面活性剤である、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル浸漬後のホルマリンから核酸を抽出する方法に関する。本発明の核酸抽出方法は、サンプル浸漬後のホルマリンに、ホルマリン中和剤を添加する工程を含むことを特徴とする。一例では、ホルマリン中和剤は、過酸化水素及び水中で過酸化水素を生成する過酸化物からなる群から選択される１以上の化合物、又は尿素及び酸を含む。また、本発明は、該抽出方法により得られた核酸を含む溶液中の目的の核酸を増幅する工程を含む、核酸の増幅方法、該増幅方法により増幅された核酸の配列を解析する工程を含む、シーケンシング方法等に関する。
続きを表示（約 3,000 文字）【背景技術】
【０００２】
近年の病理診断において、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織は、例えば、ＰＣＲや次世代シーケンシング（ＮＧＳ）等を用いた遺伝子検査等のサンプルとして広く利用され、該検査結果は、様々な疾患の診断やコンパニオン診断に用いられている（非特許文献１）。また、このようなサンプルを用いた遺伝子研究は、新規治療薬の探索等に有用である（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、生検検体などの微小検体の場合、ＦＦＰＥサンプルから回収されるＤＮＡやＲＮＡの質と量は低いため、ＰＣＲ検査等の遺伝子検査を行う事が困難であること等が報告されている（非特許文献２～４）。
【０００４】
法医学検査においても、長期間ホルマリン保存したサンプルから検査を行うことがあるが、ＤＮＡやＲＮＡの収量が少ないこと等により遺伝子検査を行うことができないという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Yasushi Y et al., Pathology International. 2020;20 (12) 921-931
Wang F et al., J Mol Diagn. 2007; 9(4):441-451
Srinivasan M et al., Am J Pathol. 2002; 161(6):1961-1971
Utako Oba et al., Biology Methods and Protocols 2022; Jul 26;7(1)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、サンプル浸漬後のホルマリンから核酸を抽出する方法を提供することを課題とする。特に、サンプル浸漬後のホルマリンに、ホルマリン中和剤を添加する工程を含むことを特徴とする、核酸の抽出方法を提供することを課題とする。一例では、過酸化水素及び水中で過酸化水素を生成する過酸化物からなる群から選択される１以上の化合物、又は尿素及び酸を含む。また、本発明は、該抽出方法により得られた核酸を含む溶液中の目的の核酸を増幅する工程を含む、核酸の増幅方法、該増幅方法により増幅された核酸の配列を解析する工程を含む、シーケンシング方法を提供することも課題とする。
【０００７】
本発明者らは、生検検体などの微小検体の場合、ＦＦＰＥサンプルから回収されるＤＮＡやＲＮＡの質と量が低いため、ＰＣＲ検査等の遺伝子検査や法医学検査を行う事が困難である場合があることや、通常の標本作製では、一断面の標本のみの作製であり疾患（例：がん）を見逃している可能性も否定できないことを鑑みて、ＦＦＰＥサンプル以外からこれらの検査に適した質と量の核酸を得ることを企図した。
【０００８】
そこで、本発明者らは、手術検体や生検検体などのサンプルの固定に用いたホルマリンに注目し、該ホルマリンから核酸を抽出することを着想した。鋭意検討した結果、驚くべきことに、手術検体や生検検体などのサンプルをホルマリンに浸漬後、該ホルマリンに、過酸化水素、又は尿素、クエン酸及び塩化カルシウムを添加することで、変性が少ない核酸を効率的に抽出し得ることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］核酸の抽出方法であって、以下：
（１）サンプル浸漬後のホルマリンに、ホルマリン中和剤を添加する工程、及び
（２）工程（１）で得られた混合物から核酸を抽出する工程
を含む、方法。
［２］ホルマリン中和剤が、過酸化水素及び水中で過酸化水素を生成する過酸化物からなる群から選択される１つ以上の化合物、又は尿素及び酸を含む、［１］に記載の方法。
［３］ホルマリン中和剤が、過酸化水素及び水中で過酸化水素を生成する過酸化物からなる群から選択される１つ以上の化合物を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］１つ以上の化合物が過酸化水素である、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］ホルマリン中和剤が、尿素及び酸を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［６］酸が、クエン酸水溶液である、［２］又は［５］に記載の方法。
［７］ホルマリン中和剤が、さらに塩化カルシウムを含む、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］工程（１）において、さらに界面活性剤を添加する、［１］～［７］のいずれか一つに記載の方法。
［９］前記界面活性剤の少なくとも１つがイオン性界面活性剤である、［８］に記載の方法。
［１０］前記イオン性界面活性剤の少なくとも１つが陰イオン性界面活性剤である、［９］に記載の方法。
［１１］前記陰イオン界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩又はアルキルエーテル硫酸エステル塩である、［１０］に記載の方法。
［１２］前記イオン性界面活性剤の少なくとも１つが陽イオン性界面活性剤である、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］陽イオン界面活性剤が第４級アンモニウム塩である、［１２］に記載の方法。
［１４］［１］～［１３］のいずれか一つに記載の方法により抽出された核酸を含む溶液中の目的の核酸を増幅する工程を含む、核酸の増幅方法。
［１５］［１４］に記載の方法により増幅された核酸の配列を解析する工程
を含む、シーケンシング方法。
［１６］過酸化水素及び水中で過酸化水素を生成する過酸化物からなる群から選択される１つ以上の化合物、又は尿素及び酸を含む、サンプル浸漬後のホルマリンから核酸を抽出するためのキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ＦＦＰＥサンプル等の従来のサンプルに依存することなく、これらのサンプルを作製する際に用いたホルマリンから、病理診断における遺伝子検査等に適した質の核酸の十分量を取得することが可能となる。そのため、生検検体のような微小検体からでも、病理診断における遺伝子検査等に適した質の核酸の十分量を取得することが可能となる。また、長期保存されたＦＦＰＥサンプル等、従来は検査不可となっていたようなサンプルについて、該サンプルの作製に用いたホルマリンが保存されていれば、ＰＣＲや次世代シーケンシング（ＮＧＳ）等を用いた遺伝子検査が可能となる。さらに、ホルマリンを含む溶液に浸漬された状態で保存されている生体組織や細胞等のサンプル（例えば、液浸標本（所謂、ホルマリン漬け）、液状化細胞診（liquid-based cytology）用標本等）に関しても、本発明により、サンプルを保存しているホルマリンから核酸を抽出し、最終的に該核酸の配列の解析を行い得るため、基礎医学や法医学、あるいは生物学分野においても様々な探索（例：新規診断マーカーや疾患の原因遺伝子の探索や特定等）が可能となる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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