発明の詳細な説明【技術分野】 【０００１】 本発明は、標的RNAに結合可能なタンパク質を用いるRNA編集技術に関する。本発明は、医療（創薬支援、治療）、農業（農水畜産物生産、育種）、化学（生物学的物質生産）などの幅広い分野で有用である。 続きを表示（約 6,200 文字）【背景技術】 【０００２】 植物のミトコンドリア及び葉緑体ではゲノム中の特定の塩基がRNAレベルで置換されるRNA編集が頻繁に起こり、この現象にRNA結合タンパク質であるペンタトリコペプチドリピート（PPR）タンパク質が介在していることが知られている。 【０００３】 PPRタンパク質は、このタンパク質を構成するPPRモチーフの構造によって、PとPLSの2つのファミリーに分類される（非特許文献1）。PクラスのPPRタンパク質が標準的な35アミノ酸のPPRモチーフ（P）の単純な繰り返しから構成されている一方、PLSタンパク質は、Pの他に、それに類似したL及びSと呼ばれる2つのモチーフを含んでいる。PLSタンパク質のPPRアレイ（PPRモチーフの並び）は、P1（約35アミノ酸）、L1（約35アミノ酸）、そしてS1（約31アミノ酸）の3つのPPRモチーフがP-L-Sの繰り返し単位として構成され、そのP1L1S1のC末端側に、少し配列の異なるP-L-S、すなわち、P2（35アミノ酸）、L2（36アミノ酸）、そしてS2（32アミノ酸）モチーフが続く。また、P-L-Sの繰り返し単位で構成されているものとは別に、SS(31アミノ酸)が繰り返している場合もある。さらにこの最後のP2L2S2モチーフのC末端側にE1及びE2と呼ばれる2つのPPR様モチーフ、そして136アミノ酸のシチジンデアミナーゼドメイン様配列を持つDYWドメインが続く場合がある（非特許文献2）。 【０００４】 PPRタンパク質とRNAの相互作用は、各PPRモチーフ中の数カ所のアミノ酸の組み合わせによって結合RNA塩基を指定するPPRコードによって規定されており、これらのアミノ酸が水素結合を介して対応するヌクレオチドと結合する（特許文献1、特許文献2、非特許文献3、非特許文献4、非特許文献5、非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8）。 【先行技術文献】 【特許文献】 【０００５】 国際公開WO2013/058404 国際公開WO2014/175284 【非特許文献】 【０００６】 Lurin, C., Andres, C., Aubourg, S., Bellaoui, M., Bitton, F., Bruyere, C., Caboche, M., Debast, C., Gualberto, J., Hoffmann, B., et al. (2004). Genome-wide analysis of Arabidopsis pentatricopeptide repeat proteins reveals their essential role in organelle biogenesis. Plant Cell 16:2089-2103. Cheng, S., Gutmann, B., Zhong, X., Ye, Y., Fisher, M. F., Bai, F., Castleden, I., Song, Y., Song, B., Huang, J., et al. (2016). Redefining the structural motifs that determine RNA binding and RNA editing by pentatricopeptide repeat proteins in land plants. Plant J. 85:532-547. Barkan, A., Rojas, M., Fujii, S., Yap, A., Chong, Y. S., Bond, C. S., and Small, I. (2012). A combinatorial amino acid code for RNA recognition by pentatricopeptide repeat proteins. PLoS Genet. 8:e1002910. Shen, C., Zhang, D., Guan, Z., Liu, Y., Yang, Z., Yang, Y., Wang, X., Wang, Q., Zhang, Q., Fan, S., et al. (2016). Structural basis for specific single-stranded RNA recognition by designer pentatricopeptide repeat proteins. Nat. Commun. 7:11285. Yagi, Y., Hayashi, S., Kobayashi, K., Hirayama, T., and Nakamura, T. (2013). Elucidation of the RNA recognition code for pentatricopeptide repeat proteins involved in organelle RNA editing in plants. PLoS One 8:e57286. Kobayashi, T., Yagi, Y., and Nakamura, T. (2019). Comprehensive Prediction of Target RNA Editing Sites for PLS-Class PPR Proteins in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 60:862-874. Yan, J., Yao, Y., Hong, S., Yang, Y., Shen, C., Zhang, Q., Zhang, D., Zou, T., and Yin, P. (2019). Delineation of pentatricopeptide repeat codes for target RNA prediction. Nucleic Acids Res. 47:3728-3738. Takenaka, M., Zehrmann, A., Brennicke, A., and Graichen, K. (2013). Improved computational target site prediction for pentatricopeptide repeat RNA editing factors. PLoS One 8:e65343. Knie, N., Grewe, F., Fischer, S., and Knoop, V. (2016). Reverse U-to-C editing exceeds C-to-U RNA editing in some ferns - a monilophyte-wide comparison of chloroplast and mitochondrial RNA editing suggests independent evolution of the two processes in both organelles. BMC Evol. Biol. 16:134. Gerke, P., Szovenyi, P., Neubauer, A., Lenz, H., Gutmann, B., McDowell, R., Small, I., Schallenberg-Rudinger, M., and Knoop, V. (2020). Towards a plant model for enigmatic U-to-C RNA editing: the organelle genomes, transcriptomes, editomes and candidate RNA editing factors in the hornwort Anthoceros agrestis. New Phytologist 225: 1974-1992. Gutmann B., Royan S., Schallenberg-Rudinger M., Lenz H., Castleden I.R., McDowell R., Vacher M.A., Tonti-Filippini J., Bond C.S., Knoop V., and Small I.D. (2020). The Expansion and Diversification of Pentatricopeptide Repeat RNA-Editing Factors in Plants. Molecular Plant 13:215-230 Oldenkott, B., Yang, Y., Lesch, E., Knoop, V., and Schallenberg-Rudinger, M. (2019). Plant-type pentatricopeptide repeat proteins with a DYW domain drive C-to-U RNA editing in Escherichia coli. Communications Biology 2:85. 【発明の概要】 【発明が解決しようとする課題】 【０００７】 陸上植物のオルガネラにおいて、RNA塩基がシチジンからウリジンに置換されるC-to-U RNA編集が一般的に起こる。しかし、ツノゴケ類や、小葉類及びシダ植物の一部では、ウリジンがシチジンへ置換されるU-to-C RNA編集も見られる（非特許文献9）。2つの異なるバイオインフォマティクス研究から、U-to-C RNA編集を持つ植物において、標準的なDYWドメインと配列の異なるユニークなDYWドメインが発見された（非特許文献10、非特許文献11）。 【０００８】 ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）由来の2種のDYW：PGタンパク質が、大腸菌内でCからUのRNA編集活性を示すことが報告された（非特許文献12)。陸上植物の進化の初期に分岐した植物群において、DYWドメインは大きく２つのグループに分類される。1つ目はDYW:PG/WWグループと呼ばれ、これには標準的なDYWドメインであるDYW：PG型及びPGボックスにトリプトファン（W）が1つ付加されたDYW:WW型が含まれる。２つ目のグループはDYW：KPと呼ばれ、このDYWドメインはPGボックスとC末端の3つのアミノ酸配列がPG／WWグループと異なる配列を持ち、さらにU-to-C RNA編集を持つ植物のみに存在する。任意のRNA配列内の1塩基を特定の塩基に変える技術は、遺伝子治療や、産業利用における遺伝子変異導入技術において有用である。これまでに、様々なRNA結合分子が開発されているが、DYWドメインと人工的なRNA結合タンパク質を用いることで、任意の標的RNAのシチジン（C）をウリジン（U）に、あるいはその逆方向であるウリジン（U）をシチジン（C）に変換する分子の設計方法は確立されていない。 【課題を解決するための手段】 【０００９】 本研究において我々は、PPR-DYWタンパク質のC末端DYWドメインを含む部分がRNA編集のモジュラードメイン（modular editing domain）として利用可能であることを示す。本研究において設計した3種のDYWドメインをそれぞれPPR-P又はPLSアレイと融合させた場合、DYW：PG及びDYW：WWドメインはC-to-U、DYW：KPはU-to-CのRNA編集活性を示した。 【００１０】 本発明は、以下を提供する。 [1] 下記a、b、c、及びbcのいずれか一のポリペプチドからなるDYWドメインを含む、人工DYWタンパク質を標的RNAに適用する、標的RNAを編集する方法。 a. x a1 PGx a2 SWIEx a3 -x a16 HP … Hx aa E … Cx a17 x a18 CH … DYWを有し、配列番号:1の配列と少なくとも40%の配列同一性を有し、かつC-to-U/U-to-C編集活性を有するポリペプチド b. x b1 PGx b2 SWWTDx b3 -x b16 HP … Hx bb E … Cx b17 x b18 CH … DYWを有し、配列番号:2の配列と少なくとも40%の配列同一性を有し、かつC-to-U/U-to-C編集活性を有するポリペプチド c. KPAx c1 Ax c2 IEx c3 … Hx cc E … Cx c4 x c5 CH … x c6 x c7 x c8 を有し、配列番号:3の配列と少なくとも40%の配列同一性を有し、かつC-to-U/U-to-C編集活性を有するポリペプチド bc. x b1 PGx b2 SWWTDx b3 -x b16 HP … Hx cc E … Cx c4 x c5 CH … Dx bc1 x bc2 を有し、配列番号:2の90の配列と少なくとも40%の配列同一性を有し、かつC-to-U/U-to-C編集活性を有するポリペプチド （配列中、xは任意のアミノ酸を表し、…は任意のポリペプチド断片を表す。） [2] 下記a、b、c、及びbcのいずれか一のポリペプチドからなるDYWドメイン。 a. x a1 PGx a2 SWIEx a3 -x a16 HP … Hx aa E … Cx a17 x a18 CH … DYWを有し、配列番号:1の配列と少なくとも40%の配列同一性を有し、かつC-to-U/U-to-C編集活性を有するポリペプチド b. x b1 PGx b2 （【００１１】以降は省略されています） この特許をJ-PlatPatで参照する
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