特許ウォッチ

公開番号2025094131
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-24
出願番号2025045517,2022180974
出願日2025-03-19,2015-03-19
発明の名称多能性細胞に関連する方法
出願人ブイセルセラピューティックス,インコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20250617BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】効率、収率および/または品質が改善された多能性細胞の生成方法を提供する。
【解決手段】本発明は、細胞からの多能性細胞の作製または生成に関する。本発明は、ストレスが、細胞に外来遺伝子も、転写産物も、タンパク質も、核成分も、細胞質も導入することを必要とせず、また細胞融合も必要とせずに細胞からの多能性幹細胞の産生を誘導し得るという本発明者らの発見に基づくものである。いくつかの実施形態では、ストレスが細胞の細胞質および/またはミトコンドリアの量の減少を誘導し、脱分化過程を惹起して多能性細胞を生じさせる。
【選択図】図5A
特許請求の範囲【請求項１】
図面に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１４年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／９５５，３６２号、２０１４年３月１９日に出願された同第６１／９５５，３５８号および２０１４年８月２８日に出願された同第６２／０４３，０４２号の利益を主張するものであり、上記仮特許出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 11,000 文字）【０００２】
本明細書に記載される技術は多能性細胞の作製に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
多能性細胞を得るために現在用いられている方法は主として、入手可能性が限られている組織（例えば、胚組織または臍帯血）または外来核酸を導入するリプログラミング因子の添加に依存するものである（Ｈａｎｎａ，Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ２００８１３３，２５０－２６４；Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ，Ｄ．ら，Ｃｅｌｌｓｔｅｍｃｅｌｌ２００８
３，３４６－３５３；Ｋｉｍ，Ｄ．ら，Ｃｅｌｌｓｔｅｍｃｅｌｌ２００９４，４７２－４７６；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ２００９４６１，６４９－６４３；Ｏｋａｂｅ，Ｍ．ら．Ｂｌｏｏｄ２００９１１４，１７６４－１７６７）。外来リプログラミング因子の添加による合併症を起こさない幹細胞、特に自家幹細胞を容易に作製する方法があれば、細胞分化の研究および幹細胞ベースの治療法の開発が加速されるものと思われる。熱傷、化学傷害、外傷および放射線照射などの刺激への曝露により細胞が損傷を受けると、正常な体細胞が変化して癌細胞になる可能性があるという仮説が提唱されているが、リプログラミング因子を特異的に操作しなくても健常成体の体細胞が他の状態に変換され得ることを直接示す証拠はない。
【０００４】
これまでに、研究者は成体組織に「成体幹細胞」を発見したことを報告している（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ．およびＷｅｉｓｓ，Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９２２５５，１７０７－１７１０；Ｍｅｇｅｎｅｙ，Ｌ．Ａ．ら，Ｇｅｎｅｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１９９６１０，１１７３－１１８３；Ｃａｐｌａｎ，Ａ．Ｉ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ１９９１９，６４１－６５０；Ｌａｖｋｅｒ，Ｒ．Ｍ．およびＳｕｎ，Ｔ．Ｔ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ１９８３８１，１２１ｓ－１２７ｓ）。このような報告には未だ議論の余地がある。例えば、幹細胞マーカーであるＯｃｔ４を発現する細胞を探求している研究者で、ホメオスタシスが正常な成体骨髄にＯｃｔ４発現細胞を発見するには至っていない研究者がいる（Ｌｅｎｇｎｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ
Ｃｙｃｌｅ２００８７，７２５－７２８；Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．およびＧｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．Ｃｅｌｓｔｅｍｃｅｌｌ２００７１，３５９－３６０）一方、様々な成体組織からＯｃｔ４発現細胞を単離することが可能であることを報告している研究者もいる（Ｊｉａｎｇ，Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ２０１０４１８，４１－４９；Ｄ’Ｉｐｐｏｌｉｔｏ，Ｇ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｅｌｌｓｃｉｅｎｃｅ２００４１１７，２９７１－２９８１；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ２００５１２２，３０３－３１５；Ｋｕｃｉａ，Ｍ．ら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ２００６２０，８５７－８６９；Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．ら，ＰＮＡＳ２０１１１０７，８６３９－８６４３；Ｏｂｏｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２０１１ＰａｒｔＡ
１７，６０７－６１５；Ｒａｈｎｅｍａｉ－Ａｚａｒ，Ａ．ら，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ２０１１１３，１７９－１９２；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ２０１０８９，６７７－６８５；Ｚｕｂａ－Ｓｕｒｍａ，Ｅ．Ｋ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１１１５，１３１９－１３２８；Ｐａｃｚｋｏｗｓｋａ，Ｅ．ら，Ａｎｎａｌｓｏｆｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ２０１１１６，５９－７１）。これらの細胞は、成体幹細胞の集団であるか、単に用いる技術による人為的影響であるかのいずれかであると仮定されてきた。いずれの場合も、このような細胞はまれであり、研究および治療を目的とする多能性細胞の十分な供給源にはならない。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書には、国際公開第２０１３／１６３２９６号およびＯｂｏｋａｔａら，Ｎａｔｕｒｅ２０１４５０５：６４１－６４７（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている方法よりも効率、収率および／または品質が向上するよう改善された、多能性細胞、例えばＳＴＡＰ細胞の生成方法が記載される。本明細書にはこのほか、本発明の方法により生成した細胞に関連する方法および使用が記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１Ａ～図１Ｄは、ＣＤ４５陽性体細胞からのＯｃｔ４発現細胞生成を示す図である。図１Ａはストレス処理胞のＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を示す。ストレス処理細胞がＯｃｔ４－ＧＦＰを発現するのに対し、未処理対照は発現しなかった。ストレス処理群の右上にはＯｃｔ４発現コロニーの拡大画像が示されている。スケールバーは１００μｍを表す。
図１Ａ～図１Ｄは、ＣＤ４５陽性体細胞からのＯｃｔ４発現細胞生成を示す図である。図１Ｂはストレス処理細胞および未ストレス処理対照の集団解析を示す。ストレス処理群にのみ第５日にＧＦＰ発現細胞集団が観察される。
図１Ａ～図１Ｄは、ＣＤ４５陽性体細胞からのＯｃｔ４発現細胞生成を示す図である。図１Ｃは、ストレス処理前およびストレス処理後第７日のＣＤ４５陽性細胞の細胞サイズ解析を示す。
図１Ａ～図１Ｄは、ＣＤ４５陽性体細胞からのＯｃｔ４発現細胞生成を示す図である。図１Ｄは、ストレス処理後のＣＤ４５陽性細胞の経時的変化を示す。
図２Ａ～図２Ｂは、動物カルス細胞（ＡＣＣ）の特徴付けを示す図である。図２Ａは多能性マーカー遺伝子の経時的な発現の変化を示す。メッセンジャーＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに対して正規化した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
図２Ａ～図２Ｂは、動物カルス細胞（ＡＣＣ）の特徴付けを示す図である。図２ＢはＯｃｔ４プロモーターおよびＮａｎｏｇプロモーター遺伝子のメチル化解析を示す。
図３Ａ～図３Ｄは、ストレス処理後の細胞改変を示す図である。図３Ａは、ＡＣＣ生成段階におけるストレス防御遺伝子の相対遺伝子発現量を示す。第３日および第７日に試料を収集し、ＣＤ４５陽性細胞と比較した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。図３Ｂは総細胞内ＡＴＰ測定値を示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。図３ＣはＲＯＳ測定値を示す。エラーバーはＳＤを表す。図３ＤはｍｔＤＮＡ複製因子の相対遺伝子発現量を示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
図３Ａ～図３Ｄは、ストレス処理後の細胞改変を示す図である。図３Ａは、ＡＣＣ生成段階におけるストレス防御遺伝子の相対遺伝子発現量を示す。第３日および第７日に試料を収集し、ＣＤ４５陽性細胞と比較した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。図３Ｂは総細胞内ＡＴＰ測定値を示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。図３ＣはＲＯＳ測定値を示す。エラーバーはＳＤを表す。図３ＤはｍｔＤＮＡ複製因子の相対遺伝子発現量を示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
図４Ａ～図４Ｂは、ＡＣＣからのキメラマウス形成を示す図である。図４Ａはキメラマウス形成のスキームを示す。パネル（ｉ）は、トリプシンによりＡＣを単一細胞に分離した後または（パネルｉｉ）ＡＣを小片に切り分けた後に胚盤胞に注入したことを示す。
図４Ａ～図４Ｂは、ＡＣＣからのキメラマウス形成を示す図である。図４Ｂはキメラ寄与解析を示す。９個体の仔の組織をＦＡＣＳにより解析した。
図５Ａ～図５Ｃは、ＡＣＣ生成条件を用いた実験を示す図である。図５Ａは、ＣＤ４５陽性細胞を様々なストレスに曝露し、ＦＡＣＳによりＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を解析したことを示す。ストレス処理後の生存細胞に含まれるＯｃｔ４－ＧＦＰ発現細胞の百分率（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
図５Ａ～図５Ｃは、ＡＣＣ生成条件を用いた実験を示す図である。図５ＢはｐＨ条件の決定を示す。ＣＤ４５陽性細胞を様々なｐＨの溶液に曝露した。ストレス処理から３日後、ＦＡＣＳによりＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を解析した。
図５Ａ～図５Ｃは、ＡＣＣ生成条件を用いた実験を示す図である。図５Ｃは培養条件の決定を示す。ストレス処理細胞を様々な培地で培養した。第１４日、ＧＦＰ発現ＡＣの数をカウントした（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
図６Ａ～図６Ｂは、ＩＣＲマウス由来のＣＤ４５陽性細胞からのＡＣＣ生成を示す図である。図６Ａはストレス処理後のＣＤ４５陽性細胞の経時的変化を示す。ＦＡＣＳによりＥ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ－１の発現を解析した。図６Ｂは、ＲＴ－ＰＣＲによりＥ－カドヘリン／ＳＳＥＡ１二重陽性細胞のＯｃｔ４遺伝子発現を確認したことを示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
図７Ａ～図７Ｂは、ＧＯＦマウス由来の様々な組織からのＡＣＣ生成を示す図である。図７Ａはストレス処理後のＯｃｔ４－ＧＦＰ発現細胞の割合を示す。様々な組織から体細胞を単離し、様々なストレスに曝露した。ＦＡＣＳによりＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を解析した。
図７Ａ～図７Ｂは、ＧＯＦマウス由来の様々な組織からのＡＣＣ生成を示す図である。図７Ｂは、様々な組織に由来するＡＣＣの胚性遺伝子発現を示す。遺伝子発現をＧＡＰＤＨにより正規化した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
最初の７日間のストレス防御遺伝子の相対遺伝子発現量を示す図である。ストレス処理後、第１日、第３日および第７日に細胞を収集し、遺伝子発現を天然のＣＤ４５陽性細胞と比較した。青のグラフは熱ショックタンパク質の遺伝子発現を表す。緑のグラフはＤＮＡ修復遺伝子の発現を表す。赤のグラフは酸化還元遺伝子の発現を表す。Ｙ軸は発現量の相対倍数を表す。
ＡＣＣの分化を示す図である。グラフはキメラ寄与解析を示す。様々な体細胞に由来するＡＣＣを用いて形成されたキメラ胚をＦＡＣＳにより解析した。グラフはＥ１３．５～Ｅ１５．５のキメラ胚５例の平均を示す。
ストレス処理が間葉－上皮転換（ＭＥＴ）を介して体細胞のリプログラミングを引き起こしたことを示す図である。天然の細胞ならびにストレス処理開始後３日目および７日目の細胞にＭＥＴ関連遺伝子の発現がみられる。ｙ軸は、その遺伝子の発現レベルを用いて試料中のレベルに対して正規化した％発現を示す。
ストレス前およびストレス後の細胞集団のＦＡＣＳ解析を示す図である。ＧＦＰ発現は明らかであり、各被験組織型由来のストレス後細胞集団に多能性細胞が生成されたことを示している。
図１２Ａ～図１２Ｅは、低ｐＨ処理が運命拘束された体細胞に運命転換を誘導したことを示す図である。図１２Ａは実験プロトコルの模式図を示す。図１２Ｂはフローサイトメトリー解析（上段：ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
／ＣＤ４５
－
；下段：未処理ＣＤ４５
＋
細胞）を示す。ｙ軸はＯｃｔ３／４：ＧＦＰ細胞の数であり、Ｘ軸はＣＤ４５
＋
細胞の数である。両軸とも主要単位である０、１００、１０００および１０，０００が記されている。図１２Ｃは、培養中の経時的なｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
生存細胞数およびｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
－
生存細胞数のグラフを示す。図１２Ｄは、Ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
細胞（左側のピーク）およびＣＤ４５
＋
細胞（右側のピーク）の細胞の大きさのグラフを示す。図１２Ｅは、単離ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
スフィアのｔｃｒβのゲノム再編成をゲノムＰＣＲにより解析した結果を示す。
図１２Ａ～図１２Ｅは、低ｐＨ処理が運命拘束された体細胞に運命転換を誘導したことを示す図である。図１２Ａは実験プロトコルの模式図を示す。図１２Ｂはフローサイトメトリー解析（上段：ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
／ＣＤ４５
－
；下段：未処理ＣＤ４５
＋
細胞）を示す。ｙ軸はＯｃｔ３／４：ＧＦＰ細胞の数であり、Ｘ軸はＣＤ４５
＋
細胞の数である。両軸とも主要単位である０、１００、１０００および１０，０００が記されている。図１２Ｃは、培養中の経時的なｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
生存細胞数およびｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
－
生存細胞数のグラフを示す。図１２Ｄは、Ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
細胞（左側のピーク）およびＣＤ４５
＋
細胞（右側のピーク）の細胞の大きさのグラフを示す。図１２Ｅは、単離ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
スフィアのｔｃｒβのゲノム再編成をゲノムＰＣＲにより解析した結果を示す。
図１２Ａ～図１２Ｅは、低ｐＨ処理が運命拘束された体細胞に運命転換を誘導したことを示す図である。図１２Ａは実験プロトコルの模式図を示す。図１２Ｂはフローサイトメトリー解析（上段：ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
／ＣＤ４５
－
；下段：未処理ＣＤ４５
＋
細胞）を示す。ｙ軸はＯｃｔ３／４：ＧＦＰ細胞の数であり、Ｘ軸はＣＤ４５
＋
細胞の数である。両軸とも主要単位である０、１００、１０００および１０，０００が記されている。図１２Ｃは、培養中の経時的なｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
生存細胞数およびｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
－
生存細胞数のグラフを示す。図１２Ｄは、Ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
細胞（左側のピーク）およびＣＤ４５
＋
細胞（右側のピーク）の細胞の大きさのグラフを示す。図１２Ｅは、単離ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
スフィアのｔｃｒβのゲノム再編成をゲノムＰＣＲにより解析した結果を示す。
図１３Ａ～図１３Ｂは、低ｐＨ誘導Ｏｃｔ３／４
＋
細胞が多能性を有することを示す図である。図１３Ａは、ｄ７の低ｐＨ誘導ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
細胞のｑＰＣＲの遺伝子発現解析をＣＤ４５
＋
細胞と比較したグラフを示す（各組とも左から右に向かってｏｃｔ３／４、ｎａｎｏｇ、ｓｏｘ２、ｅｃａｔ１、ｅｓｇ１、ｄａｘ１およびｋｌｆ４の発現を表す）。第３日および第７日に試料を収集し、ＣＤ４５陽性細胞と比較した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。図１３Ｂは、バイサルファイトシーケンシングの結果がｏｃｔ３／４プロモーターおよびｎａｎｏｇプロモーター領域のものであることを示す。ＣＤ４５
＋
細胞は、追加の培養の有無に関係なく、両プロモーターに密にメチル化されたパターンを示した。
図１４Ａ～図１４Ｂは、他の組織供給源からもＳＴＡＰ細胞が得られることを示す図である。図１４Ａは、多数の組織（各組とも左から右に向かってＣＤ４５
＋
細胞、骨髄、脳、肺、筋肉、脂肪、線維芽細胞、肝臓および軟骨細胞を表す）の培養ｄ７のｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
細胞生成の割合を示す。図１４Ｂは、ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ
＋
細胞クラスターの遺伝子発現解析のグラフを示す（各組とも左から右に向かってＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＲｅｘ１の発現を表す）。
図１５Ａ～図１５Ｂは、ＳＴＡＰ細胞の多能性細胞としての特徴付けを示す図である。図１５ＡはＳＴＡＰ細胞におけるＥＳ細胞マーカーの遺伝子発現のグラフを示す（各組とも左から右に向かってＥＳ、ＥｐｉＳＣ、ＳＴＡＰおよびＣＤ４５を表す）。図１５ＢはＳＴＡＰ細胞におけるＸ染色体不活化の％のグラフを示す。
様々なストレスに曝露したＣＤ４５陽性細胞についてＦＡＣＳにより分析したＯｃｔ４－ＧＦＰ発現のグラフを示す図である。ストレス処理後の生存細胞におけるＯｃｔ４－ＧＦＰ発現細胞の百分率（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
ｐＨ条件決定のグラフを示す図である。ＣＤ４５陽性細胞を様々なｐＨの溶液に曝露した。ストレス処理から３日後、ＦＡＣＳによりＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を解析した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
培養条件決定のグラフを示す図である。ストレス処理細胞を様々な培地で培養した。第１４日、ＧＦＰを発現するストレス変化細胞塊の数をカウントした（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
図１７Ａ～図１７Ｂは、ＩＣＲマウス由来のＣＤ４５陽性細胞からのＳＡＣ生成を示す図である。図１７Ａはストレス処理後のＣＤ４５陽性細胞の経時的変化を示す。ＦＡＣＳによりＥ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ－１の発現を解析した。図１７Ｂは、ＲＴ－ＰＣＲによって確認したＥ－カドヘリン／ＳＳＥＡ１二重陽性細胞のＯｃｔ４遺伝子発現のグラフを示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。
図１８Ａ～図１８Ｂは、ＧＯＦマウス由来の様々な組織からのＳＡＣ生成を示す図である。図１８Ａはストレス処理後のＯｃｔ４－ＧＦＰ発現細胞の割合のグラフを示す。様々な組織から体細胞を単離し、様々なストレスに曝露した。ＦＡＣＳによりＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を解析した。各組とも左から右に向かってＢＭ、脳、肺、筋肉、脂肪、線維芽細胞および肝臓を表す。
図１８Ａ～図１８Ｂは、ＧＯＦマウス由来の様々な組織からのＳＡＣ生成を示す図である。図１８Ｂは、様々な組織に由来するＳＡＣの胚性遺伝子発現のグラフを示す。ＧＡＰＤＨにより遺伝子発現を正規化した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。各組とも左から右に向かってＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＥｃａｔ１を表す。
最初の７日間のストレス防御遺伝子の相対遺伝子発現量のグラフを示す図である。ストレス処理後、第１日、第３日および第７日に細胞を収集し、遺伝子発現を天然のＣＤ４５陽性細胞と比較した。Ｙ軸は発現量の相対倍数を表す。
ＳＡＣおよびＣＤ４５＋細胞由来のＳＡＣから誘導されたキメラマウスのＴＣＲβ鎖再編成解析を示す図である。２Ｎキメラマウス＃１、＃２、＃３、＃５、＃６、＃７、＃８および＃９に再編成ＤＮＡの発現がみられた。
４Ｎキメラマウスのジェノタイピング解析を示す図である。ジェノタイピングを実施したところ、１２９／Ｓｖ×Ｂ６ＧＦＰＦ１由来のＳＡＣを用いて形成した４ＮキメラマウスおよびＩＣＲ由来の４Ｎ胚盤胞がＳＡＣ（１２９／Ｓｖ×Ｂ６ＧＦＰ）特異的遺伝子を発現することが明らかになった。
ＳＴＡＰ細胞がｉｎｖｉｖｏで胚組織および胎盤組織に寄与することを示す図である。グラフは、注入した細胞が胚部分にのみ寄与した胎児ならびに胚部分に加えて胎盤および卵黄嚢組織にも寄与した胎児の割合を示す。
図２３Ａ～図２３Ｃは、ＦＧＦ４処理がＳＴＡＰ細胞に一部のトロホブラスト系列の特徴を誘導することを示す図である。図２３Ａは、ＳＴＡＰ細胞からＴＳ様（Ｆ４Ｉ）細胞を誘導するためのＦＧＦ４処理の模式図を示す。図２３Ｂはマーカー発現のｑＰＣＲ解析のグラフを示す。図２３ＣはＦＡＣＳ解析による胎盤寄与の定量化のグラフを示す。Ｆ４Ｉ細胞とは異なり、ＥＳ細胞は検出可能なレベルで胎盤組織に寄与することはなかった。
図２４Ａ～図２４Ｄは、ＳＴＡＰ細胞からＥＳ細胞様幹細胞が誘導され得ることを示す図である。図２４ＡはＳＴＡＰ細胞からの幹細胞誘導の模式図を示す。図２４Ｂは、ＳＴＡＰ－Ｓ細胞が１２０日間にわたる維持培養で安定して増殖したことを示す。同様の結果が１６種類の独立した系統で得られた。これに対し、親ＳＴＡＰ細胞では急激に数が減少した。図２４Ｃはマーカー遺伝子発現のｑＰＣＲ解析のグラフを示す。ＥＳ細胞およびＳＴＡＰ－Ｓ細胞は、ＣＤ４５
＋
細胞には発現しなかった多能性関連遺伝子を発現した。図２４Ｄは、バイサルフェートシーケンシングによるＤＮＡメチル化試験の略図を示す。
図２４Ａ～図２４Ｄは、ＳＴＡＰ細胞からＥＳ細胞様幹細胞が誘導され得ることを示す図である。図２４ＡはＳＴＡＰ細胞からの幹細胞誘導の模式図を示す。図２４Ｂは、ＳＴＡＰ－Ｓ細胞が１２０日間にわたる維持培養で安定して増殖したことを示す。同様の結果が１６種類の独立した系統で得られた。これに対し、親ＳＴＡＰ細胞では急激に数が減少した。図２４Ｃはマーカー遺伝子発現のｑＰＣＲ解析のグラフを示す。ＥＳ細胞およびＳＴＡＰ－Ｓ細胞は、ＣＤ４５
＋
細胞には発現しなかった多能性関連遺伝子を発現した。図２４Ｄは、バイサルフェートシーケンシングによるＤＮＡメチル化試験の略図を示す。
図２５Ａ～図２５Ｂは、ＳＴＡＰ幹細胞が多能性であり、生殖系列伝達および四倍体補完法に適合性があることを示す図である。図２５Ａは、胚盤胞注入アッセイ（２Ｎ）におけるキメラマウスの様々な組織へのＳＴＡＰＳ細胞の寄与率のグラフを示す。図２５Ｂは胎盤組織への寄与率のグラフを示す。親ＳＴＡＰ細胞およびＴＳ細胞とは異なり、ＳＴＡＰＳ細胞は胎盤寄与の能力をもはや保持していなかった。３種類の独立した系統を試験し、いずれも胚部分への実質的な寄与を示した。
酸洗浄により誘導された多能性を示す図である。
上：髄腔内ＳＳＰ－ＳＡＰで処置したラットではカプサイシン注射後の肢引っ込め閾値の低下によって示される機械的痛覚過敏が減少することを示す図である。差が最も大きくなるカプサイシン注射１０分後の反応をのちのグラフに示す。下：脊髄幹細胞を埋植してから５週間後、カプサイシン誘導性痛覚過敏が回復することを示す図である。
最初に、痛覚過敏状態を大幅に減少させるＳＳＰ－ＳＡＰをｉ．ｔ．注射したラットの足にカプサイシンを注射し（図２７を参照されたい）、次いで、幹細胞の腰髄ｉ．ｔ．注射により処置した後の触覚反応（上）および熱反応（下）を示す図である。「元の反応」は何らかの処置を実施する前のカプサイシンに対する痛覚過敏反応を示す。「ＢＬ１」は、２週間前にＳＳＰ－ＳＡＰまたは不活性なＢｌａｎｋ－ＳＡＰのいずれかで処置したラットにカプサイシン注射を実施する前のベースラインの反応を示す。「ＢＬ２」は、カプサイシン注射を実施せずに幹細胞を送達してから１～２日後のベースラインの反応を示す。幹細胞埋植物によりＳＳＰ－ＳＡＰ処置ラットの痛覚過敏反応を未処置ラットおよびＢｌａｎｋ－ＳＡＰ処置対照のものに戻すことが可能であることに注目されたい。
幹細胞埋植物によってカプサイシン感受性が回復したラットでは、ＮＫ１－Ｒの特異的アンタゴニストの効力が増大することを示す図である。未処置ラット（○、□；左パネル；およびＢｌａｎｋ－ＳＡＰを投与した後、幹細胞を送達したラット、不掲載）では、両型の痛覚過敏ともＬ－７３３，０６０のＩＣ５０が約０．３ｍＭ（３０μＬのｉ．ｔ．注射）であるのに対し、幹細胞回復ラット（右パネル）では、触覚痛覚過敏（■）のＩＣ５０が約３０μＭ、熱痛覚過敏（●）のＩＣ５０が約５μＭである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（詳細な説明）
本明細書に記載される技術の諸態様は、細胞からの多能性細胞の作製または生成に関する。本明細書に記載される技術の諸態様は、ストレスが、細胞に外来遺伝子も、転写産物も、タンパク質も、核成分も、細胞質も導入することを必要とせず、また細胞融合も必要とせずに細胞からの多能性幹細胞の産生を誘導し得るという本発明者らの発見に基づくものである。いくつかの実施形態では、ストレスが細胞の細胞質および／またはミトコンドリアの量の減少を誘導し、脱分化過程を惹起して多能性細胞を生じさせる。いくつかの実施形態では、ストレスが、例えばストレスに曝露した細胞の少なくとも１０％に細胞膜の破壊を引き起こす。これらの多能性細胞は、三胚葉のそれぞれに分化する能力（ｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏ）、ｉｎｖｉｖｏでの奇形腫様細胞塊の生成ならびに生きた胚および／またはキメラマウスを生成する能力のうちの１つまたは複数を特徴とする。
【０００８】
本明細書には、特に限定されないが細胞の細胞質および／またはミトコンドリアの量を減少させるストレスを含めた特定の環境ストレスで細胞を処理すると、ミトコンドリアの活性が低下し、脱分化に関連するゲノム領域が脱メチル化され、細胞が既知の脱分化経路のマーカーを示し得ることを示す実験が記載される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞から多能性細胞を生成する方法が本明細書に提供され、この方法は、細胞から細胞質および／またはミトコンドリアの少なくとも約４０％を除去することと、多能性細胞または多能性マーカーを示す細胞を選択することとを含み、細胞が組織中に存在しない。本明細書にはこのほか、細胞から多能性細胞を生成させ得るその他のストレス処理が記載される。
【０００９】
便宜上、本願の明細書、実施例および添付の特許請求の範囲に使用する特定の用語をここにまとめる。別途記載されるか、文脈から読み取れない限り、以下の用語および語句は以下に記載する意味を包含する。別途明記されるか、文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、それと関係のある技術分野で付与されている意味を排除するものではない。定義は、特定の実施形態の説明に役立つよう記載されるものであり、また本発明の範囲は請求項によってのみ限定されることから、特許請求される発明を限定することを意図するものではない。特に明記されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１０】
本明細書で使用される「含む」という用語は、組成物、方法およびその方法または組成物に必須の各構成要素（１つまたは複数）を指すのに使用されるが、必須であるかどうかに関係なく、明記されていない要素を包含する可能性もある。
（【００１１】以降は省略されています）

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