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公開番号2025087857
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-10
出願番号2025036281,2023085382
出願日2025-03-07,2018-02-15
発明の名称トランスフェリン受容体トランスジェニックモデル
出願人デナリセラピューティクスインコーポレイテッド,Denali Therapeutics Inc.
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/62 20060101AFI20250603BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】キメラトランスフェリン受容体(TfR)ポリヌクレオチド、ポリペプチド、キメラTfRトランスジェニック動物モデル、及びその用途を提供する。
【解決手段】天然マウストランスフェリン結合部位と、特定のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインとを含むキメラトランスフェリン受容体(TfR)ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、並びにキメラTfRトランスジェニック動物モデル及び血液脳関門を通過できる治療薬を同定するために前記動物モデルを使用する方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
本明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【背景技術】
【０００１】
発明の背景
血液脳関門（ＢＢＢ）は、末梢から脳へのほとんどの高分子の移行を阻止するため、脳への曝露が必要とされる大分子治療薬の使用を制限する。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、ＢＢＢで高度に発現され、受容体媒介性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを通過させて上述のような治療薬を輸送するために使用することができる。潜在的な治療薬がＢＢＢを通過する能力を評価する目的で、マウスＴｆＲが完全長のヒトＴｆＲｃＤＮＡに置換されたマウスモデルが以前に開発された。しかしながら、これらのトランスジェニックマウスは不健康であり、異常に高いＴｆＲ発現、少ない赤血球数、及び高い血清鉄濃度を示した。Ｙｕｅｔａｌ．，ＳｃｉｅｎｃｅＴｒａｎｓ．Ｍｅｄ．，６（２６１）：２６１ｒａ１５４（２０１４）（非特許文献1）。結果として、これらの既存のマウスモデルは、脳疾患を治療するためにＢＢＢを通過することができる治療薬を評価するためのツールとしての使用には適しておらず、内因性ＴｆＲの発現及び表現型をより呈するモデルが必要とされる。
続きを表示（約 4,300 文字）【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００２】
Ｙｕｅｔａｌ．，ＳｃｉｅｎｃｅＴｒａｎｓ．Ｍｅｄ．，６（２６１）：２６１ｒａ１５４（２０１４）
【発明の概要】
【０００３】
発明の簡単な概要
一態様では、本開示は、非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位、及び配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインを含む、キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【０００４】
いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位は、天然（例えば、ＴｆＲの膜貫通及び／または細胞内ドメインと同種由来）トランスフェリン結合部位であり、例えば、天然マウストランスフェリン結合部位である。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、配列番号３との少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドの異種頂端ドメインをコードする核酸配列の領域は、配列番号２との少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドの異種頂端ドメインをコードする核酸配列の領域は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲをコードするポリヌクレオチドは、マウストランスフェリン受容体遺伝子のエクソンとイントロンとを含み、及び異種頂端ドメインをコードする核酸配列は、マウストランスフェリン受容体遺伝子の頂端結合ドメインに取って代わるようにマウストランスフェリン受容体遺伝子の第４のエクソンの後に配置されている。
【０００５】
別の態様では、非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位と、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインとを含むキメラＴｆＲポリペプチドが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、天然頂端ドメインのみが異種頂端ドメインによって置換されている天然ＴｆＲポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、天然ＴｆＲ結合部位と、例えば、頂端ドメインに加えて少なくとも１つのドメインまたはその領域が非天然アミノ酸配列を含む、天然ＴｆＲ結合部位に対して異種である頂端結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲは、配列番号３との少なくとも８０％、９０％、９５％、または９８％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【０００６】
さらなる態様では、上記のようなキメラトランスフェリン受容体を発現する宿主細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、キメラトランスフェリン受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞によって発現されるキメラＴｆＲポリペプチドは、（ａ）ＴｆＲポリペプチドの内因性頂端ドメインに代わる異種頂端ドメインと、（ｂ）内因性トランスフェリン結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、内因性ＴｆＲの頂端ドメインのみが異種頂端ドメインによって置換されているキメラＴｆＲを発現する。いくつかの態様では、宿主細胞は、内因性ＴｆＲ結合部位と、例えば、頂端ドメインに加えて少なくとも１つのドメインまたはその領域が非天然アミノ酸配列を含む、異種頂端ドメインとを含むキメラＴｆＲを発現する。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内の異種頂端ドメインをコードする核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞内の頂端ドメインをコードする核酸配列は、マウストランスフェリン受容体遺伝子の第４のエクソンの後に配置されている。いくつかの実施形態では、宿主細胞はエクスビボにある。いくつかの実施形態では、宿主細胞は胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞のゲノムは、天然ＴｆＲの頂端ドメインの欠失を含む。
【０００７】
さらなる態様では、本開示は、キメラＴｆＲポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物を提供し、キメラＴｆＲポリペプチドは、非ヒトトランスジェニック動物にとって内因性であるＴｆＲポリペプチドの頂端ドメインに取って代わる異種頂端ドメインを含む。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物のゲノムは、非ヒトトランスジェニック動物の内因性ＴｆＲの頂端ドメインに代わる異種頂端ドメインをコードするトランスフェリン受容体遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物のＴｆＲの天然ドメインに代わる異種頂端ドメインと、天然トランスフェリン結合部位とを含む、キメラＴｆＲを発現する。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、内因性トランスフェリン受容体の頂端ドメインのみが、異種頂端ドメインによって置換されているキメラトランスフェリン受容体を発現する。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、内因性ＴｆＲ結合部位と、例えば、頂端ドメインに加えて少なくとも１つのドメインまたはその領域が非天然アミノ酸配列を含む、内因性ＴｆＲ結合部位に対して異種である頂端結合ドメインとを含むキメラＴｆＲポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、上記のような宿主細胞を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、マウスまたはラットである。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、キメラＴｆＲについてホモ接合性である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、キメラＴｆＲについてヘテロ接合性である。
【０００８】
別の態様では、キメラＴｆＲに結合する頂端ドメイン結合ポリペプチド（ＡＤＢＰ）をスクリーニングする方法が本明細書に提供され、この方法は、候補ＡＤＢＰを上記のキメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップと、キメラＴｆＲポリペプチドに結合する候補ＡＤＢＰの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、候補ＡＤＢＰを、キメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップは、ＡＤＢＰを、キメラＴｆＲポリペプチドを発現する宿主細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、候補ＡＤＢＰを、キメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップは、ＡＤＢＰを、キメラＴｆＲポリペプチドを発現する内皮と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、内皮は血液脳関門内皮である。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドに結合する候補ＡＤＢＰの量は、イムノアッセイによって決定される。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドに結合する候補ＡＤＢＰの量は、表面プラズモン共鳴によって決定される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、インビボで実施される。いくつかの実施形態では、候補ＡＤＢＰは、エフェクター分子と結合している。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０００９】
さらに別の態様では、キメラＴｆＲポリペプチドに結合するＡＤＢＰの量を測定する方法が本明細書に提供され、この方法は、ＡＤＢＰを上記に開示されたキメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップと、キメラＴｆＲポリペプチドに結合したＡＤＢＰの量をイムノアッセイまたは表面プラズモン共鳴によって決定するステップとを含む。
【００１０】
さらに別の態様では、血液脳関門を通過するＡＤＢＰをスクリーニングする方法が本明細書に提供され、この方法は、（ａ）配列番号１との少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する頂端ドメインに結合するＡＤＢＰを、本明細書に開示される非ヒトトランスジェニック動物に投与するステップと、（ｂ）非ヒトトランスジェニック動物の脳内のＡＤＢＰの存在または活性を測定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＢＰは、エフェクター分子と結合している。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、決定するステップは、定量的イムノアッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態では、測定するステップは、脳内のエフェクター分子のレベルを決定するために、動物の脳または脳組織を、エフェクター分子に結合する薬剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、測定するステップは、エフェクター分子の薬力学的（ＰＤ）効果を測定することを含む。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、抗ＢＡＣＥ１抗体またはその抗原結合フラグメントであり、測定するステップは、脳内の可溶性ＡＢｅｔａ４０のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、脳内の標的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
（【００１１】以降は省略されています）

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