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公開番号2025028857
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-05
出願番号2024192680,2021512514
出願日2024-11-01,2019-09-07
発明の名称核酸塩基編集システムを送達するための組成物および方法
出願人ビームセラピューティクスインク.
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20250226BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】細胞へのCRISPR/Cas9成分の送達を達成するのを助けるための組成物および方法を提供する。
【解決手段】1つ以上のデアミナーゼ(例えばアデノシンデアミナーゼ)とnCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質の断片をそれぞれコードする第1および第2のポリヌクレオチドを送達するための組成物および方法を提供し、ここで、第1のポリヌクレオチドは、分割インテイン対のインテイン-Nに融合されたnCas9のN末端断片をコードし、第2のポリヌクレオチドは、分割インテイン対のインテイン-Cに融合されたnCas9のC末端断片をコードする。これらの断片をsgRNAと共に細胞に送達(例えばAAV送達)するための方法も提供され、これらの断片は分割インテイン系によって一緒に連結され、それによって細胞中で機能的な塩基編集系を再構成する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
(a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌ
クレオチドであって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2におけ
る番号付けでCas9のA292～G364の位置で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N
末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および
(b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記C末端
断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292～G364の位置で始まりCas9のC末端で終
結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポ
リヌクレオチド
を含む、組成物。
続きを表示（約 2,000 文字）【請求項２】
(a) Cas9のN末端断片をコードする第1のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記N末端
断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292～G364の位置で
終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合され
る、第1のポリヌクレオチド、および
(b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードする第2のポリヌ
クレオチドであって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292
～G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は分
割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項３】
(a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌ
クレオチドであって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2におけ
る番号付けでCas9のA292～G364、F445～K483、またはE565～T637の位置で終結する連続配
列であり、ここで、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌ
クレオチド、および
(b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記C末端
断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292～G364、F445～K483、またはE565～T63
7の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、ここでCas9の前記C末端断片のN
末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9の前記C末端断片は分割イ
ンテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項４】
(a) Cas9のN末端断片をコードする第1のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記N末端
断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292～G364、F445～
K483、またはE565～T637の位置で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N末端断
片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および
(b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードする第2のポリヌ
クレオチドであって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292
～G364、F445～K483、またはE565～T637の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列
であり、ここでCas9の前記C末端断片のN末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCys
であり、Cas9の前記C末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項５】
Cas9の前記N末端断片が、配列番号2における番号付けでアミノ酸302、309、312、354、
455、459、462、465、471、473、576、588、または589までを含む、請求項１～４のいず
れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Cas9の前記C末端断片またはCas9の前記N末端断片が、配列番号2における番号付けでア
ミノ酸S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S5
77、A589、またはS590に対応する残基におけるAla/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys変異を
含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
単一ガイドRNA（sgRNA）またはそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求
項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
前記第1および第2のポリヌクレオチドが連結されている、請求項１～７のいずれか一項
に記載の組成物。
【請求項９】
前記第1および第2のポリヌクレオチドが別々に発現される、請求項１～７のいずれか一
項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記デアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項１～９のいずれか一項に記
載の組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年9月7日に出願された米国仮特許出願第62/728,703号及び2018年12月13
日に出願された米国仮特許出願第62/779,404号の利益を主張するものであり、これらの全
ての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 4,000 文字）【０００２】
Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）の発見は、
分子生物学の分野に革命をもたらした。この熱狂の多くは、CRISPR/Cas9がヒトの疾患を
治療しヒトゲノムを編集する臨床的可能性に集中している。疾患を引き起こす突然変異は
、CRISPRあるいはCRISPRベースのシステムを用いて修復される可能性がある。この目標を
達成するための1つの課題は、ゲノム編集のために必要な要素を送達することである。例
えば、CRISPR/Cas9に関して、SpCas9およびsgRNAがDNAプラスミドベクター中にコードさ
れ、アデノ随伴ウイルス(AAV) を介して送達され得る。しかしながら、AAVはパッケージ
ング能力が小さいため、細胞へのCRISPR/Cas9成分の送達を達成するのを助け、および/ま
たは所望の遺伝子編集目的を満たすために他のエレメント（例えばポリペプチドドメイン
、プロモーター、レポーター、蛍光タグ、複数のsgRNA、またはHDRのためのDNAテンプレ
ートなど）を含めさせることは、困難である。
【発明の概要】
【０００３】
いくつかの態様において、 (a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク
質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のN末端断片は、Cas9のN末
端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292～G364の位置で終結する連続配列
であり、Cas9のN末端断片は分割（split）インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレ
オチド、および (b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、こ
こでCas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292～G364の位置で始まり
Cas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合され
る、第2のポリヌクレオチドを含む、組成物が本明細書で提供される。
【０００４】
いくつかの態様において、 (a) Cas9のN末端断片をコードする第1のポリヌクレオチド
であって、ここでCas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付
けでCas9のA292～G364の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテ
イン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および (b) Cas9のC末端断片とデアミナ
ーゼとを含む融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、ここでCas9
のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292～G364の位置で始まりCas9のC
末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2
のポリヌクレオチドを含む、組成物が本明細書で提供される。
【０００５】
いくつかの態様において、 (a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク
質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のN末端断片は、Cas9のN末
端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292～G364、F445～K483、またはE565
～T637の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合さ
れる、第1のポリヌクレオチド、および (b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌク
レオチドであって、ここでCas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292
～G364、F445～K483、またはE565～T637の位置で始まり、Cas9のC末端で終結する連続配
列であり、Cas9のC末端断片のN末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCysであり、
Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチドを含む、組成
物が本明細書で提供される。
【０００６】
いくつかの態様において、 (a) Cas9のN末端断片をコードする第1のポリヌクレオチド
であって、ここでCas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付
けでCas9のA292～G364、F445～K483、またはE565～T637の位置で終結する連続配列であり
、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および (
b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードする第2のポリヌク
レオチドであって、ここでCas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292
～G364、F445～K483、またはE565～T637の位置で開始し、Cas9のC末端で終結する連続配
列であり、Cas9のC末端断片のN末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCysであり、
Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチドを含む、組成
物が本明細書で提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片は、配列番号2における番号付けでアミ
ノ酸302、309、312、354、455、459、462、465、471、473、576、588、または589までを
含む。いくつかの実施形態において、Cas9のC末端断片またはCas9のN末端断片は、配列番
号2における番号付けでアミノ酸S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S46
9、T472、T474、C574、S577、A589、またはS590に対応する残基においてAla/Cys、Ser/Cy
s、またはThr/Cys突然変異を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、単一ガイド
RNA（sgRNA）またはそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形
態において、第1および第2のポリヌクレオチドは連結される。ある態様において、第1お
よび第2のポリヌクレオチドは別々に発現される。ある態様において、デアミナーゼはア
デノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、野生型TadAまたはTa
dA7.10である。ある態様において、デアミナーゼは、TadA二量体である。いくつかの実施
形態において、TadA二量体は、野生型TadAおよびTadA 7.10を含む。ある態様において、
融合タンパク質は、核局在化シグナル（NLS）を含む。いくつかの実施形態において、Cas
9のN末端断片またはCas9のC末端断片は、NLSと連結される。いくつかの実施形態において
、NLSは二部分（bipartite）NLSである。いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片
および融合タンパク質は連結されて、デアミナーゼおよびSpCas9を含む塩基エディタータ
ンパク質を形成する。ある態様において、Cas9のC末端断片および融合タンパク質は連結
されて、デアミナーゼおよびSpCas9を含む塩基エディタータンパク質を形成する。いくつ
かの態様において、SpCas9は、ニッカーゼ活性を有するか、または触媒的に不活である。
【０００８】
いくつかの態様において、本明細書に開示される融合タンパク質とCas9のN末端断片と
を含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの態様において、本明細書に開示される
融合タンパク質とCas9のC末端断片とを含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの
態様において、Cas9のN末端断片またはCas9のC末端断片とデアミナーゼとは、リンカーに
よって連結される。ある態様において、リンカーは、ペプチドリンカーである。
【０００９】
いくつかの態様において、本明細書に開示される第1および第2のポリヌクレオチドを含
むベクターが本明細書で提供される。ある態様において、ベクターはプロモーターを含む
。ある態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。ある態様において、構
成的プロモーターは、CMVまたはCAGプロモーターである。ある態様において、ベクターは
、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペ
スウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される。あ
る態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。
【００１０】
いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物または本明細書に開示されるベ
クターを含む、細胞が本明細書で提供される。ある態様において、細胞は哺乳動物細胞で
ある。
（【００１１】以降は省略されています）

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