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公開番号2025026955
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-26
出願番号2024201982,2021539108
出願日2024-11-20,2020-01-07
発明の名称細胞外マトリクスの脱水方法およびそれにより形成される粒子
出願人ミロマトリックスメディカルインコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類A61L 27/36 20060101AFI20250218BHJP(医学または獣医学;衛生学)
要約【課題】細胞外マトリクス(ECM)粒子形成方法を提供する。
【解決手段】細胞外マトリクス(ECM)を含む灌流脱細胞化哺乳類器官の1つまたは複数の部分を提供する工程;1つまたは複数のECM部分を約1℃～約30℃の温度で脱水する工程;および脱水したECM部分をミーリングに供して粒子の集団にする工程であって、前記粒子の少なくとも90%が約2 mm未満のサイズを有し、前記集団が約10%未満の含水量を有する、工程を含む、ECM粒子形成方法とする。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
細胞外マトリクス（ECM）を含む灌流脱細胞化哺乳類器官の1つまたは複数の部分を提供する工程；
1つまたは複数のECM部分を約1℃～約30℃の温度で脱水する工程；および
脱水したECM部分をミーリングに供して粒子の集団にする工程であって、前記粒子の少なくとも90％が約2 mm未満のサイズを有し、前記集団が約10％未満の含水量を有する、工程
を含む、ECM粒子形成方法。
続きを表示（約 920 文字）【請求項２】
前記ECMがブタもしくはヒトである、または
前記ECMが肝臓、心臓、肺もしくは腎臓ECMである、または
前記部分を約15℃～約25℃の温度で脱水する、または
前記部分を脱水前に生理学的に適合する溶液中に入れる、
請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記溶液が水またはPBSを含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記部分を脱水前に圧縮する、または
前記1つもしくは複数の部分を脱水前にガスで膨張させる、
請求項１～3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
前記細胞外マトリクスを含む灌流脱細胞化哺乳類器官を、その1つもしくは複数の部分を提供する前にガスで膨張させる、請求項1～4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
前記ミーリングにより、少なくとも90％の粒子が約0.15 mm未満のサイズである集団が生成される、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
前記粒子の集団をサイズにより分離する工程をさらに含む、請求項1～6のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
前記分離が、ふるいにより、前記集団を音響エネルギーに供することにより、前記集団を密度分離に供することにより、もしくは流体を用いることにより行われる、または
前記粒子を酵素消化に供する工程をさらに含む、
請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記酵素消化された粒子が高分子量コラーゲンを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
約1℃～約30℃の温度下で、ECMを含む平面的構成の灌流脱細胞化哺乳類器官またはその1つもしくは複数の部分を脱水する工程；および
脱水された部分を凍結ミーリングに供し、それによってECMの粒子の集団を提供する工程であって、前記粒子の少なくとも90％が約2 mm未満のサイズであり、かつ約10％未満の含水量を有する、工程
を含む、ECM粒子形成方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2019年1月7日に出願された米国出願第62/789,218号の出願日の恩典を主張し、その開示を参照により本明細書に組み入れる。
続きを表示（約 6,200 文字）【背景技術】
【０００２】
背景
三次元（3D）プリントは、組織工学用のスキャホールドおよびデバイスを製造する一般的な技術となりつつある。これは、患者特異的な設計、高い構造的複雑さ、および低コストでの迅速なオンデマンド製造を提供する3Dプリントの能力による。バイオ製造業における3Dプリントの広範囲の普及を制限する大きなボトルネックの1つは、「バイオ素材インク」の多様性の欠如である。
【０００３】
多くのプリント可能な素材は、体外用途ではすばらしい特性を有しているが、移植可能なバイオ素材は、生理学的条件および身体との相互作用の両方に基づく特定の特徴を必要とし、これが開発をより困難にしている。一般に、プリント可能なバイオ素材は、（1）プリント可能でなければならず、（2）生体適合性でなければならず、（3）適切な機械的特性を有していなければならず、（4）良い分解動態を有していなければならず、（5）安全な分解副産物を形成しなければならず、（6）組織への生物擬態性（biomimicry）を示さなければならない。これらの要件の各々をどのように充足するかは、どのプリント方法を使用するかおよび計画されているデバイスの末端用途に依存して若干異なる。さらに、これらの特徴の多くは、相互に対して逆に作用し得る。例えば、骨組織においては、骨芽細胞の発生および耐荷重性のために硬い素材を有することが望ましいが、これは分解を遅らせるかまたは分解されない可能性がある。柔らかい素材は、プリント可能であり素早く生分解され得るが、それらの、取り扱われる能力および特定の組織タイプに適用される能力が懸念され得る。大部分の3Dプリント構築物は、骨または軟骨用途で使用されているが、それは、大部分のプリントされるバイオ素材が、ヒドロゲルシステムの外側で、これらの組織の自然の剛性を模倣する剛性を本来的に有しているからである。
【発明の概要】
【０００４】
要旨
本開示は、例えば約10 x Yインチ、5 x Yインチ、2 x Yインチ、1 x Yインチ、0.5 x Yインチ、0.25 x Yインチまたは0.1 x Yインチであり、Yが0.1～1インチ、0.5～5インチ、0.2～1インチ、1～5インチまたは1～10インチであり得る寸法を有するその部分を含む、哺乳類の器官、例えばブタまたはヒトの器官、例えば肝臓、膵臓、腎臓、肺、脾臓または心臓由来の脱細胞化細胞外マトリクスを、熱の適用なしで脱水する方法を提供し、例えば、脱水は、約75°F未満、約70°F未満、約68°F未満、約25℃未満、約22℃未満または約19℃未満の温度で行われる。1つの態様において、当該部分は、脱水前に圧縮され得る。例えば、哺乳類器官由来の脱細胞化細胞外マトリクスの部分の厚みは、少なくとも0.01％、0.5％、1％、5％、10％、20％、50％、90％またはそれ以上圧縮され得る。1つの態様において、脱水された部分は、脱細胞化器官部分から水分を除去する周囲温度での脱水および任意の圧縮後に、元の器官の組成の大部分を維持している。脱水物は、その後、ミーリング（milling）、例えば凍結ミーリングに供され、ミーリングまたはミーリングおよび例えばふるいもしくは他のサイズ分離デバイスもしくは方法を用いるサイジング（sizing）を通じて獲得され得る、約0.01 mm～約0.05 mm、約0.05 mm～約0.1 mm、0.1 mm～約5 mm、約0.25 mm～約0.5 mm、約0.4 mm～約4 mm、約1 mm～約2 mm、約0.5 mm～約1.5 mm、約1.5 mm～約3 mmまたは約3 mm～約4 mmを含む、約0.001～0.005 mmから最大約10 mmの範囲のサイズの粒子の集団が提供され得る。全器官の細胞外マトリクスの元の組成は、脱水およびミーリングされた細胞外マトリクス粒子において、治療を可能にするまたは器官の機能を補助する3Ｄ構造のプリントに利用する器官特異的なインクを調製するための構造を提供する。インクは、溶媒、例えば水性溶媒、例えば水もしくはリン酸緩衝生理食塩水(PBS）中で組み合わせる前に脱水された粒子をサイジングすることによりまたは脱水された粒子を化学的もしくは酵素的消化に供することにより調製され得る。インクのバイオプリントは、サーマルインクジェットバイオプリント、ピエゾインクジェットバイオプリント、空気圧押し出しバイオプリント、機械押し出しバイオプリントまたはレーザー支援バイオプリントを含むがこれらに限定されない任意の方法を通じて行われ得る。したがって、粒子は、エクスビボ細胞アッセイを含むがこれらに限定されない方法またはインビボ用の組織工学構築物、例えばインビボ再モデリングのために移植されるもしくは機能的なインプラントを提供するよう細胞と組み合わされる灌流脱細胞化ECMに基づくプリントされた構造物の調製において有用な組成物で使用され得る。
[本発明1001]
細胞外マトリクス（ECM）を含む灌流脱細胞化哺乳類器官の1つまたは複数の部分を提供する工程；
1つまたは複数のECM部分を周囲温度で脱水する工程；および
脱水したECM部分をミーリングに供し、それによってECMの粒子の集団を提供する工程
を含む、ECM粒子形成方法。
[本発明1002]
前記部分を脱水前に圧縮する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記1つまたは複数の部分を、脱水前にガスで膨張させる、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記細胞外マトリクスを含む灌流脱細胞化哺乳類器官を、その1つまたは複数の部分を提供する前にガスで膨張させる、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記ECMが、肝臓、心臓、肺または腎臓ECMである、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記ECMが、ブタまたはヒトである、本発明1003の方法。
[本発明1007]
前記部分を、約1℃～約30℃の温度で脱水する、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記部分を、脱水前に生理学的に適合する溶液中に入れる、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記溶液が、水またはPBSを含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記ミーリングにより、少なくとも90％の粒子が約2 mm未満のサイズである集団が生成される、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記ミーリングにより、少なくとも90％の粒子が約0.15 mm未満のサイズである集団が生成される、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記粒子の集団をサイズにより分離する工程をさらに含む、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記分離が、ふるいにより、前記集団を音響エネルギーに供することにより、前記集団を密度分離に供することにより、または流体を用いることにより行われる、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記粒子を酵素消化に供する工程をさらに含む、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記酵素消化された粒子が高分子量コラーゲンを含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記集団が、約10％未満の含水量を有する、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
周囲温度下で、ECMを含む平面的構成の灌流脱細胞化哺乳類器官またはその1つもしくは複数の部分を脱水する工程；および
脱水された部分を凍結ミーリングに供し、それによってECMの粒子の集団を提供する工程
を含む、ECM粒子形成方法。
[本発明1018]
前記部分を圧縮する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記ECMが肝臓ECMである、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
前記部分を、約1℃～約30℃の温度で脱水する、本発明1017～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記ミーリングにより、少なくとも90％の粒子が約2 mm未満のサイズである集団が生成される、本発明1017～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
【図面の簡単な説明】
【０００５】
含水量分析。
粒子サイズ分析。
非破壊的方法で（例えば、周囲温度で）乾燥させた灌流脱細胞化肝臓細胞外マトリクス（脱水ECM；dECM）の生産物のサイズを示すゲル。1）MWマーカー（Biorad）；2）1 mg/mL、10μL；3）1 mg/mL、10μL；4）2.5 mg/mL；5）2.5 mg/mL；6）5 mg/mL；7）5 mg/mL；8）10 mg/mL；9）10 mg/mL；10）1 mg/mL、10μL；11）1 mg/mL、10μL；12）2.5 mg/mL；13）2.5 mg/mL；14）5 mg/mL；15）5 mg/mL。レーン2～9、NaOHなし；レーン10～15、NaOH添加。偶数番号のレーンは反応を室温で行ったサンプルを含み、奇数番号のレーンは反応を4℃で行ったサンプルを含む。
灌流脱細胞化マトリクスの乾燥および凍結ミーリングの例。
dECM肝臓粒子の調製および保管の例。
含水量分析。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
本開示は、脱細胞化全器官物、例えば、灌流脱細胞化全器官物の脱水により調製される脱細胞化粒子生産物を提供する。多くの脱水法は、液体の除去を達成するために高温を用いる。本発明の方法は、脱細胞化物の選択またはサイジング、任意の圧縮、その後の、定義された時間の、例えばラミナーフローフード内での、スペーシング（spacing）を用いる。1つの態様において、脱水は、生産物中の含水量を、10％未満、例えば約9％、8％、7％、または5％未満にする。1つの態様において、圧縮および脱水は、生産物中の含水量を8％未満、例えば約7％、6％、5％または4％未満にする。脱水プロセスの周囲温度は、あらゆる細胞外マトリクス成分に対して非破壊的であり、それによってより高い効能を有する可能性のある生産物を生成する。この物質は、その後、3Dプリントを含むがこれらに限定されない多くの態様において微粒子として使用され得る微粒子粉末に凍結ミーリングされ得る、またはプロテアーゼ消化を含むがこれに限定されない、温度、化学的架橋、UV架橋もしくは他の手段よる再編成を通じてプリントされ得る溶液への消化により、ゲル形成のための液体に溶解され得、3Dプリントのインクとして使用するための液体に溶解され得る。この粒子はまた、直接的な治療能、例えば、創傷への直接適用、空隙部の充填、筋内注射、トンネル状の創傷および瘻孔への適用を有し得る。
【０００７】
脱細胞化ECMのソース
1つの態様において、哺乳類器官または組織を脱細胞化する方法は、その器官または組織へのカニューレ挿入を含む。器官または組織の脈管、導管および／または空隙部は、当技術分野で公知の方法および材料を用いてカニューレ挿入され得る。器官または組織を脱細胞化する上での次の工程は、細胞破壊媒体を用いてカニューレ挿入された器官または組織を灌流することである。器官を通じた灌流は、多方向（例えば、順行および逆行）であり得る。
【０００８】
心臓のランゲンドルフ灌流は、生理学的灌流として、当技術分野における慣用技術である（4室動作モード灌流としても公知）。例えば、Dehnert, The Isolated Perfused Warm-Blooded Heart According to Langendorff, In Methods in Experimental Physiology and Pharmacology: Biological Measurement Techniques V. Biomesstechnik-Verlag March GmbH, West Germany, 1988を参照のこと。簡潔に述べると、ランゲンドルフ灌流において、大動脈がカニューレ挿入され、細胞破壊媒体を含むリザーバに接続される。細胞破壊媒体は、例えば、輸注もしくはローラーポンプにより送達される一定の流速でまたは一定の静水圧によりのいずれかで動脈を逆方向に送達され得る。両方の例において、大動脈弁は強制的に閉鎖され、灌流液は冠動脈口に向けられ（それにより、心臓の心室全体を灌流し）、ついで冠静脈洞を通じて右心房に排出される。動作モード灌流においては、第2のカニューレが左心房に接続され、灌流が逆行から順行に切り替えられ得る。肺、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、脳および手足を含む他の器官または組織を灌流する方法は、当技術分野で公知である。
【０００９】
器官または組織を脱細胞化するために、1つまたは複数の細胞破壊媒体が使用され得る。細胞破壊媒体は、通常、少なくとも1つの界面活性剤、例えばSDS、PEGまたはTriton Xを含む。細胞破壊媒体は、浸透圧的に細胞と不適合となるよう水を含み得る。あるいは、細胞破壊媒体は、細胞との浸透圧適合のために緩衝液（例えば、PBS）を含み得る。細胞破壊媒体はまた、酵素、例えば、非限定的に、1つもしくは複数のコラゲナーゼ、1つもしくは複数のジスパーゼ、1つもしくは複数のDNase、またはプロテアーゼ、例えばトリプシンを含み得る。いくつかの例において、細胞破壊媒体はまた、またはあるいは、1つまたは複数の酵素の阻害剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤および／またはコラゲナーゼ阻害剤）を含み得る。
【００１０】
特定の態様において、カニューレ挿入された器官または組織は、2つの異なる細胞破壊媒体を用いて連続的に灌流され得る。例えば、第1の細胞破壊媒体は、アニオン性界面活性剤、例えばSDSを含み得、第2の細胞破壊媒体は、イオン性界面活性剤、例えばTriton X-100を含み得る。少なくとも1つの細胞破壊媒体を用いた灌流の後、カニューレ挿入された器官または組織は、例えば、洗浄溶液および／または1つもしくは複数の酵素、例えば本明細書に開示されるものを含む溶液を用いて灌流され得る。
（【００１１】以降は省略されています）

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