特許ウォッチ

公開番号2025011200
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-23
出願番号2024177032,2021532368
出願日2024-10-09,2019-12-04
発明の名称遺伝子送達のための組み換えアデノ随伴ウイルスベクター
出願人アビオナ・セラピュ―ティクス・インコーポレイテッド,Abeona Therapeutics Inc.
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/864 20060101AFI20250116BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】遺伝子送達のための組み換えアデノ随伴ウイルスベクターの提供。
【解決手段】遺伝子療法を改善するための組み換えAAVベクター、AAVウイルスベクター、およびカプシドタンパク質、ならびにそれらの製造および使用のための方法が本明細書に提供される。アデノ随伴ウイルスベクターは、遺伝子療法のための送達ベクターとして有望である。しかしながら、それらの治療有効性は、ベクターの送達効率または限定された組織指向性によって損なわれる。したがって、より良好な治療能力を有する新しいAAVベクターに対する緊急の必要性がある。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
核酸配列が、配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
請求項１～２のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項５】
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質、および
（ｉｉ）ＡＡＶベクターであって、５’から３’の方向に、
（ａ）第一のＡＡＶ逆末端反復、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）異種核酸、
（ｄ）ポリＡテール、および
（ｅ）第二のＡＡＶ逆末端反復
を含む、ＡＡＶベクター
を含むＡＡＶウイルスベクター。
【請求項６】
前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項５に記載のＡＡＶウイルスベクター。
【請求項７】
前記プロモーターが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ハイブリッドニワトリベータアクチンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＥＦ１プロモーター、ユビキタスニワトリβアクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、最小限のＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、ＥＦｌａプロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトのβアクチンプロモーター、ＴＲＥプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、Ｇａｌ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＧＤＳプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、Ｕｂｉプロモーター、またはα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである、請求項５に記載のＡＡＶウイルスベクター。
【請求項８】
前記プロモーターが組織特異的対照プロモーターであり、前記組織特異的対照プロモーターが眼特異的プロモーターである、請求項５に記載のＡＡＶウイルスベクター。
【請求項９】
前記眼特異的プロモーターが、ＶＭＤ２プロモーター、ＰＤＥ６ｂプロモーター、またはｍＲｈｏプロモーターである、請求項８に記載のＡＡＶウイルスベクター。
【請求項１０】
前記異種核酸が、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡをコードする、請求項５～９のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスベクター。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／７７５，８７１号、２０１９年２月５日に出願された同第６２／８０１，１９５号、２０１９年６月１８日に出願された同第６２／８６３，１２６号、および２０１９年１０月１４日に出願された同第６２／９１４，８５６号に対する優先権を主張するものであり、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 14,000 文字）【０００２】
参照による配列表の組み込み
本明細書に添えて電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＡＢＥＯ＿００２＿０４ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５、作成日：２０１９年１２月３日、ファイルサイズ：５５６ｋｂ）。
【背景技術】
【０００３】
アデノ随伴ウイルスベクターは、遺伝子療法のための送達ベクターとして有望である。しかしながら、それらの治療有効性は、ベクターの送達効率または限定された組織指向性によって損なわれる。したがって、より良好な治療能力を有する新しいＡＡＶベクターに対する緊急の必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、概して、遺伝子療法の分野に関し、具体的には、新規なカプシドタンパク質を有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター粒子（ＡＡＶウイルスベクターとしても知られる）、その製造、および疾患または障害を処置または予防するための導入遺伝子を送達するためのその使用に関する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸であって、前記ＶＰ３部分が可変領域（ＶＲ）Ｉ～ＩＸを含み、
（ａ）ＶＲ－ＩＩは、アミノ酸配列ＤＮＮＧＶＫ（配列番号５４）を含み、
（ｂ）ＶＲ－ＩＩＩは、アミノ酸配列ＮＤＧＳ（配列番号５５）を含み、
（ｃ）ＶＲ－ＩＶは、アミノ酸配列ＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴ（配列番号５６）を含み、
（ｄ）ＶＲ－Ｖは、アミノ酸配列ＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＳＮＦＡＷＴＡ（配列番号５７）を含み、
（ｅ）ＶＲ－ＶＩは、アミノ酸配列ＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧ（配列番号５８）を含み、
（ｆ）ＶＲ－ＶＩＩは、アミノ酸配列ＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶ（配列番号５９）を含み、
（ｇ）ＶＲ－ＶＩＩＩは、アミノ酸配列ＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩ（配列番号６０）を含み、かつ
（ｈ）ＶＲ－ＩＸは、アミノ酸配列ＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦ（配列番号６１）を含む、核酸。
（項目２）
前記ＶＲ－Ｉ領域が、ＮＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号５３）またはＳＳＴＳＧＧＳＳ（配列番号８７）を含む、項目１に記載の核酸。
（項目３）
前記ＶＲ－Ｉ領域が、ＳＡＳＴＧＡＳ（配列番号５２）を含む、項目１または２に記載の核酸。
（項目４）
前記ＶＰ３部分が、配列番号４１の配列を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の核酸。
（項目５）
前記コードされるＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号３０または配列番号８４のアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％同一である、項目２に記載の核酸。
（項目６）
前記コードされるＡＡＶカプシドアミノ酸配列が、配列番号３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、項目３に記載の核酸。
（項目７）
前記核酸配列が、配列番号１８～２３から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である、項目４に記載の核酸。
（項目８）
前記核酸配列が、配列番号１８～２３から選択されるヌクレオチド配列と１００％同一である、項目７に記載の核酸。
（項目９）
項目１～８に記載の核酸を含むベクター。
（項目１０）
項目１～８に記載の核酸によってコードされるＡＡＶカプシドタンパク質。
（項目１１）
前記タンパク質が、配列番号３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
（項目１２）
項目１～８に記載の核酸によってコードされる前記ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶベクターと、を含むＡＡＶウイルスベクターであって、前記ＡＡＶベクターが５’から３’の方向に、
（ａ）第一のＡＡＶ逆末端反復、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）異種核酸、
（ｄ）ポリＡテール、および
（ｅ）第二のＡＡＶ逆末端反復を含む、ＡＡＶウイルスベクター。
（項目１３）
前記異種核酸が、構成的プロモーターに動作可能に連結される、項目１２に記載のＡＡＶウイルスベクター。
（項目１４）
前記異種核酸が、ポリペプチドをコードする、項目１２に記載のＡＡＶウイルスベクター。
（項目１５）
異種核酸が、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＲＮＡｉをコードする、項目１２に記載のＡＡＶウイルスベクター。
（項目１６）
前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４のアミノ酸配列を含む、項目１２に記載のＡＡＶウイルスベクター。
（項目１７）
（ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３４のアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシドタンパク質と、
（ｉｉ）ＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶベクターが５’から３’の方向に、
【図面の簡単な説明】
【０００５】
ＡＩＭカプシドライブラリー構築のための戦略。
組織培養における形質導入効率の比較。ＨＥＫ２９３細胞を、ウェル当たり５０，０００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、５Ｅ＋５のＭＯＩで、ＡＡＶ９－ＧＦＰまたはＡＡＶ２１４－ＧＦＰウイルスを含有するカプシドを用いて形質導入した。画像は形質導入後４５時間に撮影された。
２Ｅ＋１１個のＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４ウイルスのウイルスゲノム（ｖｇ）を投与されたマウスの異なる組織における形質導入効率の比較。
２Ｅ＋１１個のＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４ウイルスのｖｇを投与されたマウスの脳における形質導入効率および発現レベルの比較。
ＡＡＶ投与後のマウスの網膜の走査型レーザー眼底検査撮像。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスには、網膜下（右眼）注射および硝子体内（左眼）注射の両方によって、標識されたＡＡＶ血清型が投与された。１μＬの５Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ（５Ｅ＋９ｖｇ／眼）のＡＡＶベクターを両方の投与方法で注射し、そして動物を１０日後に、ＨＲＡ２ＳｐｅｃｔｒａｌｉｓＳｃａｎｎｉｎｇＬａｓｅｒＯｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｅ（ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、米国カリフォルニア州カールズバッド市）で撮像した。白内障が十分な観察を妨げた画像は図から省略した。
ＡＡＶ２０４－ＧＦＰを硝子体内投与したマウスの眼のＩＨＣ解析。
図４は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって霊長類においてＡＡＶ２０４またはＡＡＶ９形質導入によって媒介されるＧＦＰ発現を比較する。点線は、－ＲＴ平均プラス２または４標準偏差として計算されたバックグラウンドに対応する。
図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０
１２
個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。
図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０
１２
個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。
図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０
１２
個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。
図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０
１２
個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。
図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０
１２
個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。
図５Ａ～図５Ｆは、ＡＡＶ２０４で媒介された眼の発現を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２０４の硝子体内注射によって媒介された形質導入の広がりを示し、主に周辺であり、一部は中心窩である。図５Ｂは、ＡＡＶ２０４ウイルスの硝子体内注射後の霊長類における光受容体およびＲＰＥ細胞を含む様々な網膜細胞の（ＧＦＰ発現による）形質導入を示す。図５Ｃは、大部分の錐体（色覚を担う光受容体）が集中している黄斑における大量の光受容体およびＲＰＥ形質導入を示す。図５Ｄ～図５Ｆは、ＶＭＤ２（卵黄様黄斑変性－２プロモーター）によって駆動されるＡＡＶ２０４からのＧＦＰの発現を示し、これはＲＰＥに対する細胞特異的プロモーターである。ＳＬＯ撮像を、２．５×１０
１２
個のウイルスゲノム（ｖｇ）ベクターの硝子体内注射後、１４日目（図５Ｄ）および２８日目（図５Ｅ）に行った。図５Ｆは、２８日目の周辺におけるＧＦＰ発現および核（ＤＡＰＩ）を示す。
図６は、エクスビボで実施されたＮＨＰの眼の外植形質導入のＩＨＣ解析を示す。
中和抗体定量戦略。発光の欠如は、標的ＡＡＶが中和抗体によって結合されたことを示した。
図８は、ＡＡＶ２０４およびＡＡＶ９の異なる免疫原性を実証する。中和抗体価は、社内で開発されたプロセスを使用して得られた。ＡＡＶ９－ＬｕｃまたはｐＡ－ＡＡＶ２０４－Ｌｕｃのいずれかを、２５，０００のＭＯＩで様々な希釈の血清と共にインキュベートした。インキュベーションの後、ウイルス／血清混合物を、２０，０００個のＬｅｃ２細胞を含有するウェルに移し、そして細胞と共に２４時間インキュベートし、その後、発光を測定し、同じＭＯＩでウイルスのみで形質導入された細胞からの対照値と比較した。
図９は、気管内送達を介したＡＡＶ２０４またはＡＡＶ６（ＡＡＶ肺形質導入のベンチマーク）を使用した肺形質導入の比較を示す。
図１０Ａ～図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲアッセイ（図１０Ａ）および用量応答（図１０Ｂ）による、ＡＡＶ２０４を充填したＣＦＴＲΔＲ発現カセット処置に対する、ＣＦＴＲΔＲおよび完全長発現カセットの機能性を示す。図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲによってアッセイされた膜電位に関して、ＣＦＴＲΔＲ対完全長コドン最適化ＣＦＴＲ発現の比較を示す。タンパク質を発現するＡＡＶ２０４を用いて２９３個の細胞を形質導入し、蛍光の変化をモニターした。ベースラインを１分間読み取り、次いで５０μＭのフォルスコリンを細胞に添加した。
図１０Ａ～図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲアッセイ（図１０Ａ）および用量応答（図１０Ｂ）による、ＡＡＶ２０４を充填したＣＦＴＲΔＲ発現カセット処置に対する、ＣＦＴＲΔＲおよび完全長発現カセットの機能性を示す。図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲによってアッセイされた膜電位に関して、ＣＦＴＲΔＲ対完全長コドン最適化ＣＦＴＲ発現の比較を示す。タンパク質を発現するＡＡＶ２０４を用いて２９３個の細胞を形質導入し、蛍光の変化をモニターした。ベースラインを１分間読み取り、次いで５０μＭのフォルスコリンを細胞に添加した。
図１０Ａ～図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲアッセイ（図１０Ａ）および用量応答（図１０Ｂ）による、ＡＡＶ２０４を充填したＣＦＴＲΔＲ発現カセット処置に対する、ＣＦＴＲΔＲおよび完全長発現カセットの機能性を示す。図１０Ｃは、ＦＬＩＰＲによってアッセイされた膜電位に関して、ＣＦＴＲΔＲ対完全長コドン最適化ＣＦＴＲ発現の比較を示す。タンパク質を発現するＡＡＶ２０４を用いて２９３個の細胞を形質導入し、蛍光の変化をモニターした。ベースラインを１分間読み取り、次いで５０μＭのフォルスコリンを細胞に添加した。
図１１Ａ～図１１Ｃは、ＡＡＶ２０４の培養したＣＦ患者の細胞を形質導入する能力（図１１Ａ）、ＣＦＴＲΔＲ発現、および細胞膜における適切な局在化（図１１Ｂ）、およびヒトＣＦ患者の細胞におけるＣＦＴＲ電流を回復させるＣＦＴＲΔＲの発現（図１１Ｃ）を示す。
図１１Ａ～図１１Ｃは、ＡＡＶ２０４の培養したＣＦ患者の細胞を形質導入する能力（図１１Ａ）、ＣＦＴＲΔＲ発現、および細胞膜における適切な局在化（図１１Ｂ）、およびヒトＣＦ患者の細胞におけるＣＦＴＲ電流を回復させるＣＦＴＲΔＲの発現（図１１Ｃ）を示す。
図１１Ａ～図１１Ｃは、ＡＡＶ２０４の培養したＣＦ患者の細胞を形質導入する能力（図１１Ａ）、ＣＦＴＲΔＲ発現、および細胞膜における適切な局在化（図１１Ｂ）、およびヒトＣＦ患者の細胞におけるＣＦＴＲ電流を回復させるＣＦＴＲΔＲの発現（図１１Ｃ）を示す。
図１２Ａは、嚢胞性線維症のマウスモデルに対して、ＣＦＴＲ導入遺伝子を含むＡＡＶ２０４粒子を鼻に投与することのインビボ効果を示す。
図１２Ｂは、異なるＣＦ患者の細胞におけるＡＡＶ２０４／ＣＦＴＲΔＲ処置（鼻の膜電位の増加による）治療の効果を示す。
図１３は、ウイルス粒子の静脈内投与の３０日後のＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスモデルにおけるＡＡＶ９－ＣＬＮ３ベクターおよびＡＡＶ２１４－ＣＬＮ３ベクターの生体内分布を示す。
図１４は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウス脳組織におけるＡＡＶ９－ＣＬＮ３ベクターおよびＡＡＶ２１４－ＣＬＮ３ベクターの発現を示す。
図１５は、形質導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＬＡ発現の免疫ブロットを示す。
図１６は、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血漿、脳、肝臓、脊髄、心臓、腎臓、および眼のＧＬＡの酵素活性（超生理学的な）を示す。
図１７は、静脈内注射によるＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける脳、二頭筋、横隔膜、および肝臓におけるＧＡＡの酵素活性を示す。
図１８Ａ～図１８Ｂは、トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞内で発現された組み換えｈＧＡＡの免疫ブロット解析（図１８Ａ）および酵素解析（図１８Ｂ）を示す。
図１８Ａ～図１８Ｂは、トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞内で発現された組み換えｈＧＡＡの免疫ブロット解析（図１８Ａ）および酵素解析（図１８Ｂ）を示す。
図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。
図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。
図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。
図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。
図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。
図１９Ａ～図１９Ｅは、ＡＡＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウス内の血漿（図１９Ａ）、脳（図１９Ｂ）、二頭筋（図１９Ｃ）、横隔膜（図１９Ｄ）、または肝臓（図１９Ｅ）におけるＧＡＡの酵素活性を示す。図１９Ｆは、ＡＡＶカプシドでＩＶ処置されたＧＡＡ－／－マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。データは、ＧＡＡ－／－マウスに見られるグリコーゲンの％として提示される。グリコーゲンの減少は、コドン最適化ＧＡＡ酵素のＡＡＶ９およびＡＡＶ２１４媒介性発現によるＧＡＡ機能性の回復を示す。
図２０は、ＡＡＶ２０４（配列番号２）およびＡＡＶ６（配列番号６３）からのＶＰ１アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２０は、ＡＡＶ２０４（配列番号２）およびＡＡＶ６（配列番号６３）からのＶＰ１アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２１は、ＡＡＶ２１４（配列番号３）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３０）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８４）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３１）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３２）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３３）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号３４）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号４９）、ＡＡＶ９（配列番号７１）、およびＡＡＶ８（配列番号６７）からのＶＰ１タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２１は、ＡＡＶ２１４（配列番号３）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３０）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８４）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３１）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３２）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３３）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号３４）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号４９）、ＡＡＶ９（配列番号７１）、およびＡＡＶ８（配列番号６７）からのＶＰ１タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２１は、ＡＡＶ２１４（配列番号３）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３０）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８４）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３１）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３２）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３３）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号３４）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号４９）、ＡＡＶ９（配列番号７１）、およびＡＡＶ８（配列番号６７）からのＶＰ１タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２２は、ＡＡＶ２１４（配列番号３５）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３６）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８５）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３７）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３８）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３９）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４０）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５０）、ＡＡＶ９（配列番号７２）、およびＡＡＶ８（配列番号６８）からのＶＰ２タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２２は、ＡＡＶ２１４（配列番号３５）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３６）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８５）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３７）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３８）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３９）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４０）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５０）、ＡＡＶ９（配列番号７２）、およびＡＡＶ８（配列番号６８）からのＶＰ２タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２２は、ＡＡＶ２１４（配列番号３５）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３６）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８５）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３７）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３８）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３９）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４０）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５０）、ＡＡＶ９（配列番号７２）、およびＡＡＶ８（配列番号６８）からのＶＰ２タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２３は、ＡＡＶ２１４（配列番号４１）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号４２）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８６）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号４３）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号４４）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号４５）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４６）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５１）、ＡＡＶ９（配列番号７３）、およびＡＡＶ８（配列番号６９）からのＶＰ３タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２３は、ＡＡＶ２１４（配列番号４１）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号４２）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８６）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号４３）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号４４）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号４５）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４６）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５１）、ＡＡＶ９（配列番号７３）、およびＡＡＶ８（配列番号６９）からのＶＰ３タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２３は、ＡＡＶ２１４（配列番号４１）、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号４２）、ＡＡＶ２１４ＡＢ（配列番号８６）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号４３）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号４４）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号４５）、ＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号４６）、ＩＴＢ２０４＿４５（配列番号５１）、ＡＡＶ９（配列番号７３）、およびＡＡＶ８（配列番号６９）からのＶＰ３タンパク質アミノ酸配列のアライメントを示す。
図２４Ａは、筋肉内投与後の筋肉におけるＡＡＶ１１０ベクター粒子およびＡＡＶ９ベクター粒子によって送達されるＧＦＰ導入遺伝子の発現を示す。上のパネルは、白色の光で左右の脚を示し、全体的な組織構造を示している。下のパネルはＧＦＰ蛍光を示す。
図２４Ｂは、ＡＡＶ１１０粒子（ＩＴＣｏｒｄ１．１０）について、ＡＡＶ９と比較して、図２４Ａで得られた蛍光の定量的解析を提供する。
図２５Ａ～図２５Ｃは、筋肉内投与後にＡＡＶ１１０粒子（ＩＴＣｏｒｄ１．１０）によって送達される導入遺伝子の発現をＡＡＶ９に対して図示する。データは、筋肉におけるＡＡＶ１１０の発現が特に高いことを示す。
図２５Ａ～図２５Ｃは、筋肉内投与後にＡＡＶ１１０粒子（ＩＴＣｏｒｄ１．１０）によって送達される導入遺伝子の発現をＡＡＶ９に対して図示する。データは、筋肉におけるＡＡＶ１１０の発現が特に高いことを示す。
図２５Ａ～図２５Ｃは、筋肉内投与後にＡＡＶ１１０粒子（ＩＴＣｏｒｄ１．１０）によって送達される導入遺伝子の発現をＡＡＶ９に対して図示する。データは、筋肉におけるＡＡＶ１１０の発現が特に高いことを示す。
図２６Ａは、ＧＦＰを発現するＡＡＶ１１０およびＡＡＶ９粒子の筋肉内投与後のＧＦＰ発現を検出するための筋組織の免疫組織化学を示す。図は、ＡＡＶ９ベクター粒子（左下パネル）から発現されたＧＦＰ、ＡＡＶ１１０粒子（右下パネル）から発現されたＧＦＰ、および対照筋肉（上パネル）を示す。組織を抗ＧＦＰ抗体で染色した。
ＩＭ送達されたＡＡＶ２１４は、ＡＡＶ９より大きい筋肉面積を形質導入する。ラットの筋肉（大腿二頭筋）全体を、ＩＭ注射の１０日後に免疫組織化学によりＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ発現について解析した。固定凍結切片をＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙｐＡｂでプローブした。ＡＡＶ２１４は、注射部位と一致する筋肉の上部部分にほぼ限定されたＡＡＶ９と比較して、著しくより大きい形質導入区域を示す。
図２７は、導入遺伝子として発現され、かつルシフェリンに曝露されたルシフェラーゼを示す生物発光画像を示す。データは、ＡＡＶ２１４投与の２８日後に得られた。
図２８は、ＡＡＶ２１４およびＡＡＶ９で静脈内に送達されたＳＭＮ－１タンパク質の筋肉発現を比較する。
図２９は、ＡＡＶ２１４対ＡＡＶ９のバリアントによって媒介される導入遺伝子としての心臓および二頭筋におけるＧＦＰの発現を示す。ｙ軸は、ゲノムＤＮＡのマイクログラム当たりのウイルスコピー数のｌｏｇ１０値を示す。
図３０は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の線図を示す。ＶＰ１特異的部分およびＶＰ２特異的部分は、ＶＰ３部分と共に示されており、これは産生されたＶＰ３タンパク質と同一である。ＡＡＶ２１４ＶＰ３（配列番号４１）のアミノ酸配列が示され、また可変領域Ｉ－ＩＸが示されている。ＡＡＶ２１４に対する完全なＶＰ１タンパク質アミノ酸配列は、配列番号３として提供される。
図３１Ａ～図３１Ｃは、ＡＡＶ９中和抗体の生成の減少を実証する、ＡＡＶ２１４で処置された動物を図示する。図３１Ａは、ＡＡＶ９に対する中和抗体についてアッセイされた、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４のいずれかをＩＭによって投与された動物を示す。動物血清の、許容細胞型Ｌｅｃ２へのＡＡＶ９ルシフェラーゼベクターの形質導入を阻害する能力を測定することによって解析を実施した。形質導入の３日後、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。各群は、対照、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２１４のいずれかに対して２匹または３匹のラットから成る。図３１Ｂおよび図３１Ｃは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ２０４に対する交差反応性を示す。図３１Ｂは、ＡＡＶ９チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。図３１Ｃは、ＡＡＶ２０４チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。
図３１Ａ～図３１Ｃは、ＡＡＶ９中和抗体の生成の減少を実証する、ＡＡＶ２１４で処置された動物を図示する。図３１Ａは、ＡＡＶ９に対する中和抗体についてアッセイされた、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４のいずれかをＩＭによって投与された動物を示す。動物血清の、許容細胞型Ｌｅｃ２へのＡＡＶ９ルシフェラーゼベクターの形質導入を阻害する能力を測定することによって解析を実施した。形質導入の３日後、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。各群は、対照、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２１４のいずれかに対して２匹または３匹のラットから成る。図３１Ｂおよび図３１Ｃは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ２０４に対する交差反応性を示す。図３１Ｂは、ＡＡＶ９チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。図３１Ｃは、ＡＡＶ２０４チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。
図３１Ａ～図３１Ｃは、ＡＡＶ９中和抗体の生成の減少を実証する、ＡＡＶ２１４で処置された動物を図示する。図３１Ａは、ＡＡＶ９に対する中和抗体についてアッセイされた、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２１４のいずれかをＩＭによって投与された動物を示す。動物血清の、許容細胞型Ｌｅｃ２へのＡＡＶ９ルシフェラーゼベクターの形質導入を阻害する能力を測定することによって解析を実施した。形質導入の３日後、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。各群は、対照、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２１４のいずれかに対して２匹または３匹のラットから成る。図３１Ｂおよび図３１Ｃは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ２０４に対する交差反応性を示す。図３１Ｂは、ＡＡＶ９チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。図３１Ｃは、ＡＡＶ２０４チャレンジ後の様々なＡＡＶ中和抗体の発生を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本開示による一部の実施形態は、以下により完全に記述される。しかしながら、本開示の態様は、異なる形態で具体化されてもよく、また本明細書に記載する実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完璧かつ完全であるように提供され、また本発明の範囲を当業者に完全に伝達することになる。本明細書の記述で使用される用語は、特定の実施形態の記述の目的のみのものであり、限定することを意図しない。
【０００７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術的用語および科学的用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書に定義される用語などの用語は、本出願および関連技術の文脈においてその意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであり、また本明細書に明示的に定義されない限り、理想化された意味または過度に形式的な意味で解釈されるべきでないことがさらに理解されるであろう。
【０００８】
文脈で別途示されない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴を任意の組み合わせで使用することができることが具体的に意図される。さらに、本開示はまた、実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略することができることも企図する。例証するために、本明細書が、複合体が構成成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと記載する場合、Ａ、Ｂ、もしくはＣ、またはそれらの組み合わせのいずれかを省略し、かつ単独でまたは任意の組み合わせで放棄することができることが具体的に意図される。
【０００９】
別段の明示的な指示がない限り、指定された一部の実施形態、特徴、および用語はすべて、列挙された実施形態、特徴、または用語、ならびにその生物学的同等物の両方を含むことを意図する。
【００１０】
参照による組み込み
本明細書に引用されるすべての参考文献、記事、刊行物、特許、特許刊行物、および特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許刊行物、および特許出願に言及することは、世界中の任意の国で、有効な先行技術を構成する、または共通の一般知識の一部を形成するという承認または任意の形態の示唆として解釈するべきではない。
（【００１１】以降は省略されています）

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