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公開番号2024169018
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-05
出願番号2023086187
出願日2023-05-25
発明の名称培養上清液の製造方法
出願人株式会社U-Factor
代理人弁理士法人プロテクトスタンス
主分類C12N 5/0775 20100101AFI20241128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】有効成分を高濃度に含む培養上清液を大量に作製する、培養上清液の製造方法を提供する。
【解決手段】培養上清液の製造方法は、(a)担体、間葉系幹細胞、及び血清を含む培養液(以下、FBS-DMEM)を培養槽に供給する工程と、(b)間葉系幹細胞を担体へ接着させる工程と、(c)FBS-DMEMを使って間葉系幹細胞を培養する工程と、(d)フィルタ内に担体に接着した間葉系幹細胞を残し、FBS-DMEMを除去する工程と、(e)培養槽、担体に接着した間葉系幹細、及びフィルタを洗浄する工程と、(f)血清を含まない上清液用の培養液(以下、CM-DMEM)を培養槽に供給する工程と、(g)CM-DMEMを使って間葉系幹細胞を培養する工程と、(h)フィルタ内に担体に接着した間葉系幹細胞を残し、CM-DMEMを回収する工程と、を備える。
【選択図】図3
特許請求の範囲【請求項１】
間葉系幹細胞を培養した培養液から前記間葉系幹細胞を除去した培養上清液の製造方法であって、
（ａ）担体、前記間葉系幹細胞、及び血清を含む培養液（以下、ＦＢＳ－ＤＭＥＭ）を培養槽に供給する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程後、前記間葉系幹細胞を前記担体へ接着させる工程と、
（ｃ）前記ＦＢＳ－ＤＭＥＭを使って前記間葉系幹細胞を培養する工程と、
（ｄ）フィルタ内に前記担体に接着した前記間葉系幹細胞を残し、前記ＦＢＳ－ＤＭＥＭを除去する工程と、
（ｅ）前記（ｃ）工程後、前記培養槽、前記担体に接着した前記間葉系幹細、及び前記フィルタを洗浄する工程と、
（ｆ）前記（ｄ）工程後、血清を含まない上清液用の培養液（以下、ＣＭ－ＤＭＥＭ）を培養槽に供給する工程と、
（ｇ）前記ＣＭ－ＤＭＥＭを使って前記間葉系幹細胞を培養する工程と、
（ｈ）前記フィルタ内に前記担体に接着した前記間葉系幹細胞を残し、前記ＣＭ－ＤＭＥＭを回収する工程と、
を備える培養上清液の製造方法。
続きを表示（約 900 文字）【請求項２】
前記（ｂ）工程は、前記担体が前記ＦＢＳ－ＤＭＥＭ中に浮遊するように前記ＦＢＳ－ＤＭＥＭが攪拌される第一期間と、攪拌を止める第二期間とを有する、請求項１に記載の培養上清液の製造方法。
【請求項３】
前記（ｃ）工程は、前記担体が前記ＦＢＳ－ＤＭＥＭ中に浮遊するように前記ＦＢＳ－ＤＭＥＭが攪拌される、請求項１に記載の培養上清液の製造方法。
【請求項４】
前記（ｇ）工程は、前記担体が前記ＣＭ－ＤＭＥＭ中に浮遊するように、前記ＣＭ－ＤＭＥＭが攪拌される、請求項１に記載の培養上清液の製造方法。
【請求項５】
前記フィルタのメッシュサイズが、７０メッシュから４００メッシュである、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の培養上清液の製造方法。
【請求項６】
前記（ａ）工程から前記（ｅ）工程後に、前記（ｆ）工程、前記（ｇ）工程及び前記（ｈ）工程が連続して繰り返される、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の培養上清液の製造方法。
【請求項７】
前記（ｆ）工程、前記（ｇ）工程及び前記（ｈ）工程が２回から４回連続して繰り返される、請求項６に記載の培養上清液の製造方法。
【請求項８】
回収した前記ＣＭ－ＤＭＥＭに、サイトカイン及びエクソソームの少なくとも一方が所定値よりも少ない場合に、前記（ｃ）工程及び前記（ｅ）工程が一度だけ行われ、
回収した前記ＣＭ－ＤＭＥＭに、サイトカイン及びエクソソームの少なくとも一方が所定値よりも多い場合に、前記（ｆ）工程、前記（ｇ）工程及び前記（ｈ）工程が連続して繰り返される、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の培養上清液の製造方法。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞が不死化された幹細胞である、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の培養上清液の製造方法。
【請求項１０】
不死化された前記幹細胞が乳歯歯髄幹細胞である、請求項９に記載の培養上清液の製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の培養上清液を製造する製造方法に関する。
続きを表示（約 1,500 文字）【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞を使った医療においては、幹細胞自体が治療効果をもたらすだけでなく、幹細胞が分泌するサイトカインやエクソソーム等の種々の生理活性物質が治療効果に大きく寄与していることが分かっている。間葉系幹細胞を人工的に培養すると、培養液中に細胞からこれらのサイトカイン等が放出されることから、間葉系幹細胞を除去した培養液を培養上清液として回収し有効利用することができる。
【０００３】
特許文献１には、透過性膜中空糸の内表面に播種した間葉系幹細胞に培養液を供給する工程と、間葉系幹細胞に培養液を接触させて間葉系幹細胞を培養する工程と、間葉系幹細胞が分泌した成分を含む培養液を回収する工程を含む培養上清液の製造方法が開示されている。特許文献１の発明は、培養上清液を簡便に作製することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特許６９５８３５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１の発明は、作製される培養上清が少ないという問題がある。
そこで本発明は、間葉系幹細胞を使って、有効成分を高濃度に含む培養上清液を大量に作製する、培養上清液の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本実施形態は、間葉系幹細胞を培養した培養液から間葉系幹細胞を除去した培養上清液の製造方法である。その製造方法は、（ａ）担体、間葉系幹細胞、及び血清を含む培養液（以下、ＦＢＳ－ＤＭＥＭ）を培養槽に供給する工程と、（ｂ）間葉系幹細胞を担体へ接着させる工程と、（ｃ）ＦＢＳ－ＤＭＥＭを使って間葉系幹細胞を培養する工程と、（ｄ）フィルタ内に担体に接着した間葉系幹細胞を残し、ＦＢＳ－ＤＭＥＭを除去する工程と、（ｅ）培養槽、担体に接着した間葉系幹細、及びフィルタを洗浄する工程と、（ｆ）血清を含まない上清液用の培養液（以下、ＣＭ－ＤＭＥＭ）を培養槽に供給する工程と、（ｇ）ＣＭ－ＤＭＥＭを使って間葉系幹細胞を培養する工程と、（ｈ）フィルタ内に担体に接着した間葉系幹細胞を残し、ＣＭ－ＤＭＥＭを回収する工程と、を備える。
【０００７】
（ｂ）工程は、担体がＦＢＳ－ＤＭＥＭ中に浮遊するようにＦＢＳ－ＤＭＥＭを攪拌する第一期間と、攪拌を止める第二期間とを有してもよい。
また（ｃ）工程は、担体がＦＢＳ－ＤＭＥＭ中に浮遊するようにＦＢＳ－ＤＭＥＭが攪拌されてもよい。
また（ｇ）工程は、担体がＣＭ－ＤＭＥＭ中に浮遊するようにＣＭ－ＤＭＥＭが攪拌されてもよい。
【０００８】
フィルタのメッシュサイズが、７０メッシュから４００メッシュであることが好ましい。
（ａ）工程から（ｅ）工程後に、（ｆ）工程から（ｈ）工程が連続して繰り返されることが好ましい。
また（ｆ）工程から（ｈ）工程が２回から４回連続して繰り返されても良い。
【０００９】
回収したＣＭ－ＤＭＥＭに、サイトカイン及びエクソソームの少なくとも一方が所定値よりも少ない場合に、（ｃ）工程及び（ｅ）工程が一度だけ行われ、
回収したＣＭ－ＤＭＥＭに、サイトカイン及びエクソソームの少なくとも一方が所定値よりも多い場合に、（ｆ）工程から（ｈ）工程が連続して繰り返されても良い。
【００１０】
間葉系幹細胞が不死化された幹細胞であることが好ましく、さらに不死化された幹細胞が乳歯歯髄幹細胞であることが好ましい。
（【００１１】以降は省略されています）

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